Докторська школа імені родини Юхименків

Permanent URI for this community

https://ekmair.ukma.edu.ua/handle/123456789/35502

Browse

Browsing Докторська школа імені родини Юхименків by Author "Антонюк, Максим"

Now showing 1 - 1 of 1
  • Thumbnail Image
    Item
    Експресивність стійкості до борошнистої роси у інтрогресивних лініях пшениці м'якої : дисертація на здобуття наукового ступеня доктора філософії
    (2025) Плигун, Вікторія; Антонюк, Максим
    У дисертаційному дослідженні описано прояв стійкості у гібридного рослинного матеріалу, отриманого через інтрогресивну гібридизацію з залученням генетичного матеріалу ліній-похідних амфідиплоїдів (ААВВХХ), які мають геноми диплоїдних дикорослих видів (ХХ) та субгеноми А та В пшениці м’якої Аврора (ААВВDD). У роботі використано лінії Авротіки (ААВВТТ), Авродесу (ААВВSS), Аврозису (ААВВSshSsh) та Авролати (ААВВUU). Останній геном амфідиплоїдів походить від Amblyopyrum muticum Boiss. (van Slageren) (Aegilops mutica Boiss), Aegilops speltoides, Aegilops sharonensis, Aegilops umbellulata, відповідно. З використанням інтрогресивних ліній та низки сортів пшениці м’якої отримані популяції, які розщеплюються за дослідною ознакою у трьох поколіннях (F1-3). Схрещували контрастні генотипи – стійкі лінії та сорти, які уражуються патогеном. Гібриди отримані за різних напрямків схрещувань – прямого (інтрогресивна лінія була материнською рослиною) та зворотного (лінія була донором пилку для запилення сорту). Одні з гібридів, отримані через запилення стійких гібридів F2 сортом, який міг бути відмінний від того, з яким отримано материнську рослину F1. Отриманий рослинний матеріал оцінювали у польових умовах та добирали для вивчення за структурою генів ті рослини, що зберігають ознаку у поколіннях. Оцінено рослинний матеріал за ознакою стійкості – батьківські генотипи та гібриди. Серед доступних у біологічній базі даних GenBank відібрано сиквенси шести генів стійкості до борошнистої роси: Pm2, Pm3, Pm4b, Pm8, Pm21, Pm24, Pm41. Серед перерахованих, для Pm2, Pm3 та Pm24 знайдено декілька сиквенсів. В межах кожного з генів ідентифіковані відмінності: інсерції / делеції (одно-, двонуклеотидні), транзиції та трансверсії. Серед кодувальних ділянок, які мають гени, найбільше варіюють LRR кодувальні частини у Pm3. Наявність таких варіацій може впливати на амінокислотний склад білків. Ідентифікована різниця між послідовностями в межах кожного з генів є статистично недостовірною (р<0,05), що було доведено через розрахунок критерію Колмогорова – Смірнова (для Pm24) та критерію нуклеотидної різноманітності Тадзіми (для Pm2, Pm3). Проте варіювання нуклеотидного складу генів може впливати на амінокислотний склад білків стійкості та їхнє функціонування. З використанням послідовностей перерахованих генів та проведеного біоінформатичного аналізу створено 20 пар праймерів до консервативних послідовностей Pm, які кодують: Rx N-термінальний, С2, протеїнкіназоподібний, NB-ARC домени, повтори, багаті на лейцин, рослинну С-кінцеву фосфорибозилтрансферазу, каталітичний домен серин / треонінової кінази інтерлейкін-1 асоційованої рецептор-асоційованої кінази (serine/threonine kinase interleukin-1 receptor associated kinase, STKc-IRAK). Відслідковано наявність послідовностей геному, які можна пов’язати зі стійкістю, за допомогою ділянок генів стійкості, які використовували як маркерні. Проаналізовані батьківські генотипи (амфідиплоїди, лінії та сорти) з метою пошуку поліморфізму за послідовностями генів стійкості. Припускаємо, що джерелом бажаної ознаки є послідовності геному диплоїдного виду або ж ці ділянки опосередковано впливатимуть на резистентність – мають позитивний ефект на прояв дії генів, які мають пшеничні геноми. Тому вивчали і амфідиплоїди за структурою генів стійкості, щоб визначати які ділянки вони мають та які ділянки отримають генотипи, створені за їхньої участі. Для вивчення рослинного матеріалу використовували два підходи. Під час першого – аналізували з використанням праймерів, створених до Pm. Під час другого підходу послуговувалися методикою поліморфізму аналогів стійкості (RGAP), оскільки вона дозволяє виявляти ділянки геномів, притаманні для генів стійкості. Для RGAP використовували дев’ять праймерів до послідовностей генів стійкості до цист нематод у гексаплоїдної пшениці (ген Cre3), Xanthomonas oryzae pv. oryzae у рису (ген Xa21), Pseudomonas syringae у арабідопсису (ген RPS2). Праймери були комплементарні до ділянок, які кодують повтори, багаті на лейцин та кіназні домени. Ці праймери комбінували у пари, так, що в одній парі могли опинитись праймери до різних кодувальних ділянок, різних генів стійкості, одночасно два правих чи два лівих праймера. В складі геномів ідентифіковано ділянки, характерні для генів Pm2, Pm3, Pm4b, Pm8, Pm21, Pm41. Послідовності Pm24 не виявлено. Сиксенс, розміщений у базі даних, отриманий з китайського місцевого зразку, тому ген може бути відсутній у рослин з європейської частини континенту або ж послідовності, до яких створені праймери, зазнали змін. Мінливість за дослідними ділянками була у наявності або відсутності конкретної ділянки у геномі. Найбільшу варіабельність отримано з праймерами, які створені до LRR- кодувальних послідовностей Pm3, що узгоджується з літературними даними та проведеним біоінформатичним дослідженням сиквенсів. В цьому випадку поліморфізм полягав у присутності / відсутності мінорних компонентів у електрофоретичному спектрі, які мали більшу рухливість у електричному полі, порівняно з основним компонентом. Послідовності перелічених генів виявлені у складі як стійких, так і уражених генотипів. З використанням методики RGAP отримано багатокомпонентні та поліморфні спектри. Різниця між генотипами знайдена з використанням праймерів до послідовностей, які кодують лейцинові повтори, домен NB-ARC, домен з протеїнкіназною активністю. Через аналіз контрастних генотипів за молекулярною організацією генів стійкості, за представленістю цільових ділянок були відібрані комбінації праймерів, які дозволили відрізнити батьківські генотипи та в подальшому аналізувати гібридні популяції, створені за їхньою участю. Показано, що інтрогресивні лінії відрізняються за кількістю електрофоретичних компонентів від Авротіки. Спектри лінії мають більшу кількість компонентів. Це може свідчити про різну кількість послідовностей геному Т, які отримали лінії, або перебудовами пшеничних субгеномів, які міг викликати чужинний хроматин. Відмінність у спектрах Авротіки та ліній не впливає на опірність патогенові. З метою збільшення інструментальної бази для дослідження рослин об’єднували у пари праймери, створені до Pm, як це робили при використанні техніки поліморфізму аналогів генів стійкості. Оскільки була знайдена різниця між генотипами з праймерами, створеними до ділянок, які кодують LRR, нуклеотидозв’язувальний домен та кіназні домени, то створювали пари так, щоб хоча би один з праймерів був створений до цих ділянок. Такий підхід дозволив ідентифікувати варіабельність за ділянками, характерними для гена Pm2. Через поєднання технік аналізу поліморфізму аналогів генів стійкості та групового аналізу популяцій вивчали популяції, які розщеплюються за дослідною ознакою. Гібриди, об’єднували у групи, базуючись на їхньому спільному походженні – інтрогресивній лінії, з якою отримано гібриди. Аналізували дві контрастні групи. В одну групу об’єднували ДНК від стійких генотипів (ліній, стійких гібридів), в іншу – від чутливих (сортів, чутливих гібридів). Отримали три покоління гібридів, частина з яких втрачала стійкість у поколіннях, тому ДНК від таких рослин не включали в групи. З рослинним матеріалом, який потенційно може мати генетичний матеріал від Авродесу, між контрастними групами знайдена варіабельність з праймерами, створеними до LRR. У випадку Аврозису та Авротіки – з NB-ARC та праймерами до ділянок, які кодують домени з протеїнкіназною активністю. Поведінку хроматину чужинного походження та його вплив на пшеничний геном було вивчено і під час мейотичного поділу, який визначає, який хроматин потрапить до складу гамет, які залучаються у запилення. Так само впливатиме і поєднання гамет. Наявність інтрогресій під час вивчення чавлених препаратів материнських клітин пилку спостерігали як наявність хромосомних асоціацій відмінних від закритих біваленентів – унівалентів, відкритих бівалентів та мультивалентів (тривалентів та квадривалентів). Сорти пшениці м’якої є цитологічно стабільними, у складі метафазної пластинки мають 21 закритий бівалент. МКП сорту пшениці м’якої Аврора могли утворювати 1-2 відкритих біваленти через наявність житньої транслокації 1BL·1RS у геномі сорту. МКП Авротіки мали всі згадані типи хромосом, проте така їхня поведінка у мейозі не впливає на прояв ознаки на рівні рослини. Поєднання в одному геномі інтрогресованого хроматину та пшеничного може впливати на кон’югацію між гомологічними ділянками, так що втрачатиметься не тільки хроматин чужинного походження. Спостерігали утворення хромосомних мостів, мікроядер, які, як і хромосоми, які не є бівалентами, будуть відставати під час руху до полюсів та можуть дати початок мікроядрам. Утворювалися і фрагменти хромосом. Відхилення від нормального поділу може бути через відсутність гомологічних ділянок між хромосомами. Мікроядра спостерігали на різних стадіях першого та другого поділу. На цитологічну стабільність впливає напрямок схрещування – гібриди, в яких материнскою рослиною була інтрогресивна лінія, мають більшу кількість мікроядер у тетрадах, порівняно з реципроками. Хроматин, який відходить від загальної хромосомної маси буде втрачений під час поділу, що спостерігали на стадії тетрад – частина мікроядер відокремлювалася разом з цитоплазмою. Можливо, так відбувається стабілізація гібридного геному. Вивчення рослинного матеріалу з інтрогресіями проведено через молекулярний аналіз генотипів за консервативними послідовностями, характерними для генів стійкості до патогенів та через аналіз поведінки хромосом у гібридних геномах. Поєднання молекулярного та цитологічного підходів забезпечило вивчення, як соматичної частини рослини через аналіз нуклеотидних послідовностей, так і генеративної (вивчення мейозу). Спостереження кон’югації хромосом у мейозі дозволило прослідкувати поведінку хроматину різного походження, об’єднаного у одному геномі. В подальшому це дозволить поєднати результати, отримані через вивчення нуклеотидних послідовностей генів стійкості та визначати, чи є вони у складі основних ядер клітин, які проходять поділ, чи елімінуються.