Експресивність стійкості до борошнистої роси у інтрогресивних лініях пшениці м'якої : дисертація на здобуття наукового ступеня доктора філософії
Loading...
Date
2025
Authors
Плигун, Вікторія
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
У дисертаційному дослідженні описано прояв стійкості у гібридного рослинного матеріалу, отриманого через інтрогресивну гібридизацію з залученням генетичного матеріалу ліній-похідних амфідиплоїдів (ААВВХХ), які мають геноми диплоїдних дикорослих видів (ХХ) та субгеноми А та В пшениці м’якої Аврора (ААВВDD). У роботі використано лінії Авротіки (ААВВТТ), Авродесу (ААВВSS), Аврозису (ААВВSshSsh) та Авролати (ААВВUU). Останній геном амфідиплоїдів походить від Amblyopyrum muticum Boiss. (van Slageren) (Aegilops mutica Boiss), Aegilops speltoides, Aegilops sharonensis, Aegilops umbellulata, відповідно. З використанням інтрогресивних ліній та низки сортів пшениці м’якої отримані популяції, які розщеплюються за дослідною ознакою у трьох поколіннях (F1-3). Схрещували контрастні генотипи – стійкі лінії та сорти, які уражуються патогеном. Гібриди отримані за різних напрямків схрещувань – прямого (інтрогресивна лінія була материнською рослиною) та зворотного (лінія була донором пилку для запилення сорту). Одні з гібридів, отримані через запилення стійких гібридів F2 сортом, який міг бути відмінний від того, з яким отримано материнську рослину F1. Отриманий рослинний матеріал оцінювали у польових умовах та добирали для вивчення за структурою генів ті рослини, що зберігають ознаку у поколіннях. Оцінено рослинний матеріал за ознакою стійкості – батьківські генотипи та гібриди. Серед доступних у біологічній базі даних GenBank відібрано сиквенси шести генів стійкості до борошнистої роси: Pm2, Pm3, Pm4b, Pm8, Pm21, Pm24, Pm41. Серед перерахованих, для Pm2, Pm3 та Pm24 знайдено декілька сиквенсів. В межах кожного з генів ідентифіковані відмінності: інсерції / делеції (одно-, двонуклеотидні), транзиції та трансверсії. Серед кодувальних ділянок, які мають гени, найбільше варіюють LRR кодувальні частини у Pm3. Наявність таких варіацій може впливати на амінокислотний склад білків. Ідентифікована різниця між послідовностями в межах кожного з генів є статистично недостовірною (р<0,05), що було доведено через розрахунок критерію Колмогорова – Смірнова (для Pm24) та критерію нуклеотидної різноманітності Тадзіми (для Pm2, Pm3). Проте варіювання нуклеотидного складу генів може впливати на амінокислотний склад білків стійкості та їхнє функціонування. З використанням послідовностей перерахованих генів та проведеного біоінформатичного аналізу створено 20 пар праймерів до консервативних послідовностей Pm, які кодують: Rx N-термінальний, С2, протеїнкіназоподібний, NB-ARC домени, повтори, багаті на лейцин, рослинну С-кінцеву фосфорибозилтрансферазу, каталітичний домен серин / треонінової кінази інтерлейкін-1 асоційованої рецептор-асоційованої кінази (serine/threonine kinase interleukin-1 receptor associated kinase, STKc-IRAK). Відслідковано наявність послідовностей геному, які можна пов’язати зі стійкістю, за допомогою ділянок генів стійкості, які використовували як маркерні. Проаналізовані батьківські генотипи (амфідиплоїди, лінії та сорти) з метою пошуку поліморфізму за послідовностями генів стійкості. Припускаємо, що джерелом бажаної ознаки є послідовності геному диплоїдного виду або ж ці ділянки опосередковано впливатимуть на резистентність – мають позитивний ефект на прояв дії генів, які мають пшеничні геноми. Тому вивчали і амфідиплоїди за структурою генів стійкості, щоб визначати які ділянки вони мають та які ділянки отримають генотипи, створені за їхньої участі. Для вивчення рослинного матеріалу використовували два підходи. Під час першого – аналізували з використанням праймерів, створених до Pm. Під час другого підходу послуговувалися методикою поліморфізму аналогів стійкості (RGAP), оскільки вона дозволяє виявляти ділянки геномів, притаманні для генів стійкості. Для RGAP використовували дев’ять праймерів до послідовностей генів стійкості до цист нематод у гексаплоїдної пшениці (ген Cre3), Xanthomonas oryzae pv. oryzae у рису (ген Xa21), Pseudomonas syringae у арабідопсису (ген RPS2). Праймери були комплементарні до ділянок, які кодують повтори, багаті на лейцин та кіназні домени. Ці праймери комбінували у пари, так, що в одній парі могли опинитись праймери до різних кодувальних ділянок, різних генів стійкості, одночасно два правих чи два лівих праймера. В складі геномів ідентифіковано ділянки, характерні для генів Pm2, Pm3, Pm4b, Pm8, Pm21, Pm41. Послідовності Pm24 не виявлено. Сиксенс, розміщений у базі даних, отриманий з китайського місцевого зразку, тому ген може бути відсутній у рослин з європейської частини континенту або ж послідовності, до яких створені праймери, зазнали змін. Мінливість за дослідними ділянками була у наявності або відсутності конкретної ділянки у геномі. Найбільшу варіабельність отримано з праймерами, які створені до LRR- кодувальних послідовностей Pm3, що узгоджується з літературними даними та проведеним біоінформатичним дослідженням сиквенсів. В цьому випадку поліморфізм полягав у присутності / відсутності мінорних компонентів у електрофоретичному спектрі, які мали більшу рухливість у електричному полі, порівняно з основним компонентом. Послідовності перелічених генів виявлені у складі як стійких, так і уражених генотипів. З використанням методики RGAP отримано багатокомпонентні та поліморфні спектри. Різниця між генотипами знайдена з використанням праймерів до послідовностей, які кодують лейцинові повтори, домен NB-ARC, домен з протеїнкіназною активністю. Через аналіз контрастних генотипів за молекулярною організацією генів стійкості, за представленістю цільових ділянок були відібрані комбінації праймерів, які дозволили відрізнити батьківські генотипи та в подальшому аналізувати гібридні популяції, створені за їхньою участю. Показано, що інтрогресивні лінії відрізняються за кількістю електрофоретичних компонентів від Авротіки. Спектри лінії мають більшу кількість компонентів. Це може свідчити про різну кількість послідовностей геному Т, які отримали лінії, або перебудовами пшеничних субгеномів, які міг викликати чужинний хроматин. Відмінність у спектрах Авротіки та ліній не впливає на опірність патогенові. З метою збільшення інструментальної бази для дослідження рослин об’єднували у пари праймери, створені до Pm, як це робили при використанні техніки поліморфізму аналогів генів стійкості. Оскільки була знайдена різниця між генотипами з праймерами, створеними до ділянок, які кодують LRR, нуклеотидозв’язувальний домен та кіназні домени, то створювали пари так, щоб хоча би один з праймерів був створений до цих ділянок. Такий підхід дозволив ідентифікувати варіабельність за ділянками, характерними для гена Pm2. Через поєднання технік аналізу поліморфізму аналогів генів стійкості та групового аналізу популяцій вивчали популяції, які розщеплюються за дослідною ознакою. Гібриди, об’єднували у групи, базуючись на їхньому спільному походженні – інтрогресивній лінії, з якою отримано гібриди.
Аналізували дві контрастні групи. В одну групу об’єднували ДНК від стійких генотипів (ліній, стійких гібридів), в іншу – від чутливих (сортів, чутливих гібридів). Отримали три покоління гібридів, частина з яких втрачала стійкість у поколіннях, тому ДНК від таких рослин не включали в групи. З рослинним матеріалом, який потенційно може мати генетичний матеріал від Авродесу, між контрастними групами знайдена варіабельність з праймерами, створеними до LRR. У випадку Аврозису та Авротіки – з NB-ARC та праймерами до ділянок, які кодують домени з протеїнкіназною активністю. Поведінку хроматину чужинного походження та його вплив на пшеничний геном було вивчено і під час мейотичного поділу, який визначає, який хроматин потрапить до складу гамет, які залучаються у запилення. Так само впливатиме і поєднання гамет. Наявність інтрогресій під час вивчення чавлених препаратів материнських клітин пилку спостерігали як наявність хромосомних асоціацій відмінних від закритих біваленентів – унівалентів, відкритих бівалентів та мультивалентів (тривалентів та квадривалентів). Сорти пшениці м’якої є цитологічно стабільними, у складі метафазної пластинки мають 21 закритий бівалент. МКП сорту пшениці м’якої Аврора могли утворювати 1-2 відкритих біваленти через наявність житньої транслокації 1BL·1RS у геномі сорту. МКП Авротіки мали всі згадані типи хромосом, проте така їхня поведінка у мейозі не впливає на прояв ознаки на рівні рослини. Поєднання в одному геномі інтрогресованого хроматину та пшеничного може впливати на кон’югацію між гомологічними ділянками, так що втрачатиметься не тільки хроматин чужинного походження. Спостерігали утворення хромосомних мостів, мікроядер, які, як і хромосоми, які не є бівалентами, будуть відставати
під час руху до полюсів та можуть дати початок мікроядрам. Утворювалися і фрагменти хромосом. Відхилення від нормального поділу може бути через відсутність гомологічних ділянок між хромосомами. Мікроядра спостерігали на різних стадіях першого та другого поділу. На цитологічну стабільність впливає напрямок схрещування – гібриди, в яких материнскою рослиною була інтрогресивна лінія, мають більшу кількість мікроядер у тетрадах, порівняно з реципроками. Хроматин, який відходить від загальної хромосомної маси буде втрачений під час поділу, що спостерігали на стадії тетрад – частина мікроядер відокремлювалася разом з цитоплазмою. Можливо, так відбувається стабілізація гібридного геному. Вивчення рослинного матеріалу з інтрогресіями проведено через молекулярний аналіз генотипів за консервативними послідовностями, характерними для генів стійкості до патогенів та через аналіз поведінки хромосом у гібридних геномах. Поєднання молекулярного та цитологічного підходів забезпечило вивчення, як соматичної частини рослини через аналіз
нуклеотидних послідовностей, так і генеративної (вивчення мейозу). Спостереження кон’югації хромосом у мейозі дозволило прослідкувати поведінку хроматину різного походження, об’єднаного у одному геномі. В подальшому це дозволить поєднати результати, отримані через вивчення нуклеотидних послідовностей генів стійкості та визначати, чи є вони у складі основних ядер клітин, які проходять поділ, чи елімінуються.
Description
The dissertation study describes the manifestation of resistance in hybrid plant material obtained through introgressive hybridization involving genetic material of amphidiploid-derived lines (ААВВХХ), which have the genomes of diploid wild species (XX) and subgenomes A and B of soft Aurora wheat (ААВВDD). Common wheat introgressive lines derived from amphidiploids Aurotica (ААВВТТ), Autodes (ААВВSS), Aurosis (ААВВSshS sh) and Aurolata (ААВВUU) were used in the work. The third subgenome of amphidiploids comes from Amblyopyrum muticum Boiss. (van Slageren) (Aegilops mutica Boiss), Aegilops speltoides, Aegilops sharonensis, Aegilops umbellulata, respectively. Using introgressive lines and a number of common wheat varieties, segregating populations were obtained and assessed for the trait of interest in three generations (F1-3). Contrasting genotypes, which were resistant introgressive lines and susceptible wheat varieties, were crossed. Hybrids were obtained in different directions of crosses - direct (the introgressive line was the mother plant) and reverse (the line was a pollen donor for pollination of the variety). Some hybrids were obtained through pollination of stable F2 hybrids with a variety that could be different from that with which the mother plant, F1 hybrid was obtained. The plant material was assessed in the field and those plants that retain the trait in generations were selected for the study of gene structure. Paternal genotypes and hybrids were assessed for resistance to powdery mildew. Sequences of six genes of resistance to powdery mildew: Pm2, Pm3, Pm4b, Pm8, Pm21, Pm24, Pm41 were selected among the available in the biological database GenBank. For genes Pm2, Pm3 and Pm24 several sequences were found. In sequences of all the studied genes differences were identified: insertions/deletions (one-, two-nucleotide), transitions and transversions. Among the coding regions of the studied genes, the LRR coding parts in Pm3 vary the most. The presence of such variations can affect the amino acid sequences of the proteins. The identified differences between the sequences within each of the genes were statistically unreliable (p < 0.05), which was proved through the calculation of the KolmogorovSmirnov test (for Pm24) and the Tajima nucleotide diversity test (for Pm2, Pm3). However, variation in the nucleotide sequences of genes can affect the amino acid sequences of resistance proteins and their functioning. Using the sequences of the listed genes and bioinformatic analysis, 20 pairs of primers to conserved Pm sequences were developed, encoding: Rx N-terminal, C2, protein kinase-like, NBARC domains, leucine-rich repeats, plant C-terminal phosphoribosyltransferase, serine/threonine kinase interleukin-1 receptor associated kinase (STKc-IRAK). The presence of genome sequences that can associated with resistance was tracked using regions of resistance genes that were used as markers. Parental genotypes (amphidiploids, lines and varieties) were analyzed in order to search for polymorphisms in sequences of resistance genes. We assume that the source of the desired trait is the sequences of the genome of a diploid species, or these regions could indirectly influence resistance - they could have positive effect on the manifestation of genes that are present in wheat genomes. Therefore, amphidiploids were also studied for the structure of resistance genes to determine which regions they contain and which regions will receive genotypes developed with their participation. Two approaches were used to study the plant material. According to the first approach, genotypes was analyzed using primers developed to Pm. According to the second approach, the method of polymorphism of resistance analogues (RGAP) was used, since it allows to identify regions of genomes inherent to resistance genes. For RGAP, nine primers to sequences of nematode cysts resistance genes in hexaploid wheat (Cre3 gene), Xanthomonas oryzae pv. oryzae in rice (gene Xa21), Pseudomonas syringae in Arabidopsis (gene RPS2) were used. Primers were complementary to regions encoding leucine-rich repeats and kinase domains. These primers were combined in pairs, so that in one pair there could be primers to different coding sites, different resistance genes, simultaneously two right or two left primers. In the genomes of the studies plants specific regions characteristic to the genes Pm2, Pm3, Pm4b, Pm8, Pm21, Pm41 were identified. No Pm24 sequence was found. The sequence placed in the was obtained from a Chinese local sample, so the gene may be absent in plants from the European part of the continent, or the sequences to which the primers were developed have undergone changes. Variability across the studied regions was in the presence or absence of a specific site in the genome. The greatest variability was observed with primers to the LRR-coding sequences of the Pm3, which is consistent with the literature data and the conducted bioinformatic study of sequences. In this case, the polymorphism was represented by the presence/absence of minor components in the electrophoretic spectrum, which had greater mobility in the electric field compared to the main component. The sequences of these genes were found in both resistant and susceptible genotypes. Using the RGAP technique, multicomponent and polymorphic spectra were obtained. The difference between genotypes was found using primers to sequences encoding leucine repeats, an NB-ARC domain, and domain with protein kinase activity. Basing on the analysis of contrasting genotypes for the molecular organization of resistance genes, combinations of primers were selected by the representation of target sites, which made it possible to distinguish parental genotypes and further analyse hybrid populations developed with their participation. It was shown that introgressive lines differ in the number of electrophoretic components from Aurotica. Line spectra have more components. This may indicate a different number of T genome sequences that received lines, or rearrangements of wheat subgenomes that alien chromatin could cause. The differences in the spectra of Aurotica and lines did not affect the resistance to the pathogen. In order to increase the instrumental base for plant research, primers complementary to Pm genes were paired, as it was done using the polymorphism technique of resistance gene analogues. Since differences were found between genotypes with primers complementary to the sites encoding the LRR, nucleotidebinding domain and kinase domains, pairs were made so that at least one of the primers was complementary to these sites. This approach made it possible to identify variability in the regions characteristic to the Pm2 gene. Using the combination of techniques for analysing polymorphism of resistance gene analogues and bulked segregant analysis (BSA), segregating populations were studied. Hybrids were grouped based on their common origin - the introgressive line from which hybrids were obtained. Two contrast groups were analyzed. DNA was combined into one group from resistant genotypes (lines, resistant hybrids), into another - from susceptible (varieties, susceptible hybrids). Three generations of hybrids were obtained, some of which lost resistance in generations, so DNA from such plants was not included in the groups. With plant material that could potentially have genetic material from Aurodes, variability was found between contrast groups with primers complementary to the region codding LRR. In the case of Aurosis and Aurotica, polymorphism was observed with NB-ARCs and primers to sites encoding domains with protein kinase activity. The behaviour of alien chromatin and its effects on the wheat genome was also studied during meiotic division, which determines which chromatin the gametes would receive and would be involved in pollination. The presence of introgressions during the study of cytological preparations of maternal pollen cells was observed as the presence of chromosomal associations other than closed bivalents - univalents, open bivalents and multivalents (trivalents and quadrivents). Common wheat varieties are cytologically stable, that is, 21 closed bivalents are present in the metaphase plate. MMC of Aurora could form 1-2 open bivalents due to the presence of rye translocation 1BL 1RS in the genome of the variety. MMC of Aurotica had all the mentioned types of chromosomes, but their behaviour in meiosis does not affect the manifestation of the trait at the plant level. The combination of introgressed chromatin and wheat chromatin in one genome can affect conjugation between homologous sites, so that not only alien chromatin will be lost. We observed the formation of chromosomal bridges, micronuclei, which, like chromosomes that are not bivalents, will lag behind when moving to the poles and can give rise to micronuclei. Fragments of chromosomes were also formed. Deviation from normal division may be due to the absence of homologous regions between chromosomes. Micronuclei were observed at different stages of the first and second division. Cytological stability is affected by the direction of crossing - hybrids in which the mother plant was an introgressive line have a greater number of micronuclei in tetrads than reciprocs. Chromatin, which parts from the total chromosomal mass, will be lost during the separation observed at the tetrad stage - part of the micronuclei separated together with the cytoplasm. Perhaps this is how the stabilization of the hybrid genome occurs. The study of plant material with introgressions was carried out through the molecular analysis of genotypes by conserved sequences characteristic of genes for resistance to pathogens and through the analysis of chromosome behavior in hybrid genomes. The combination of molecular and cytological approaches provided the study of both the somatic part of the plant through the analysis of nucleotide sequences and the generative (study of meiosis). Observation of chromosome conjugation in meiosis allowed us to trace the behavior of chromatin of different origins, combined in one genome. In the future, this will allow combining the results obtained through the study of nucleotide sequences of resistance genes and determine whether they are part of the main nuclei of cells that undergo division or will be eliminated.
Keywords
пшениця м’яка, геном рослин, стабільність геному, дикорослі види, інтрогресія, функціонально-структурні властивості генів, регуляція експресії генів, аналіз послідовностей генів, ПЛР-маркери, борошниста роса, молекулярно-клітинні механізми, патогени, цитологічна стабільність, стійкість рослин, материнські клітини пилку, дисертація, bread wheat, plant genome, genome stability, wild species, introgression, functional-structural properties of genes, regulation of gene expression, gene sequence analysis, PCR markers, powdery mildew, plant resistance, pathogens, cytological stability, molecular-cellular mechanisms, pollen mother cells.
Citation
Плигун В. В. Експресивність стійкості до борошнистої роси у інтрогресивних лініях пшениці м'якої : дисертація на здобуття наукового ступеня доктора філософії / Плигун Вікторія Володимирівна ; наук. кер. Антонюк Максим Зиновійович ; Міністерство освіти і науки України, Національний університет "Києво-Могилянська академія". - Київ : [НаУКМА], 2025. - 325 c.