091 Біологія та біохімія
Permanent URI for this collection
Освітньо-професійна програма / Освітньо-наукова програма: Біологія
Browse
Recent Submissions
Item Експресивність стійкості до борошнистої роси у інтрогресивних лініях пшениці м'якої : дисертація на здобуття наукового ступеня доктора філософії(2025) Плигун, Вікторія; Антонюк, МаксимУ дисертаційному дослідженні описано прояв стійкості у гібридного рослинного матеріалу, отриманого через інтрогресивну гібридизацію з залученням генетичного матеріалу ліній-похідних амфідиплоїдів (ААВВХХ), які мають геноми диплоїдних дикорослих видів (ХХ) та субгеноми А та В пшениці м’якої Аврора (ААВВDD). У роботі використано лінії Авротіки (ААВВТТ), Авродесу (ААВВSS), Аврозису (ААВВSshSsh) та Авролати (ААВВUU). Останній геном амфідиплоїдів походить від Amblyopyrum muticum Boiss. (van Slageren) (Aegilops mutica Boiss), Aegilops speltoides, Aegilops sharonensis, Aegilops umbellulata, відповідно. З використанням інтрогресивних ліній та низки сортів пшениці м’якої отримані популяції, які розщеплюються за дослідною ознакою у трьох поколіннях (F1-3). Схрещували контрастні генотипи – стійкі лінії та сорти, які уражуються патогеном. Гібриди отримані за різних напрямків схрещувань – прямого (інтрогресивна лінія була материнською рослиною) та зворотного (лінія була донором пилку для запилення сорту). Одні з гібридів, отримані через запилення стійких гібридів F2 сортом, який міг бути відмінний від того, з яким отримано материнську рослину F1. Отриманий рослинний матеріал оцінювали у польових умовах та добирали для вивчення за структурою генів ті рослини, що зберігають ознаку у поколіннях. Оцінено рослинний матеріал за ознакою стійкості – батьківські генотипи та гібриди. Серед доступних у біологічній базі даних GenBank відібрано сиквенси шести генів стійкості до борошнистої роси: Pm2, Pm3, Pm4b, Pm8, Pm21, Pm24, Pm41. Серед перерахованих, для Pm2, Pm3 та Pm24 знайдено декілька сиквенсів. В межах кожного з генів ідентифіковані відмінності: інсерції / делеції (одно-, двонуклеотидні), транзиції та трансверсії. Серед кодувальних ділянок, які мають гени, найбільше варіюють LRR кодувальні частини у Pm3. Наявність таких варіацій може впливати на амінокислотний склад білків. Ідентифікована різниця між послідовностями в межах кожного з генів є статистично недостовірною (р<0,05), що було доведено через розрахунок критерію Колмогорова – Смірнова (для Pm24) та критерію нуклеотидної різноманітності Тадзіми (для Pm2, Pm3). Проте варіювання нуклеотидного складу генів може впливати на амінокислотний склад білків стійкості та їхнє функціонування. З використанням послідовностей перерахованих генів та проведеного біоінформатичного аналізу створено 20 пар праймерів до консервативних послідовностей Pm, які кодують: Rx N-термінальний, С2, протеїнкіназоподібний, NB-ARC домени, повтори, багаті на лейцин, рослинну С-кінцеву фосфорибозилтрансферазу, каталітичний домен серин / треонінової кінази інтерлейкін-1 асоційованої рецептор-асоційованої кінази (serine/threonine kinase interleukin-1 receptor associated kinase, STKc-IRAK). Відслідковано наявність послідовностей геному, які можна пов’язати зі стійкістю, за допомогою ділянок генів стійкості, які використовували як маркерні. Проаналізовані батьківські генотипи (амфідиплоїди, лінії та сорти) з метою пошуку поліморфізму за послідовностями генів стійкості. Припускаємо, що джерелом бажаної ознаки є послідовності геному диплоїдного виду або ж ці ділянки опосередковано впливатимуть на резистентність – мають позитивний ефект на прояв дії генів, які мають пшеничні геноми. Тому вивчали і амфідиплоїди за структурою генів стійкості, щоб визначати які ділянки вони мають та які ділянки отримають генотипи, створені за їхньої участі. Для вивчення рослинного матеріалу використовували два підходи. Під час першого – аналізували з використанням праймерів, створених до Pm. Під час другого підходу послуговувалися методикою поліморфізму аналогів стійкості (RGAP), оскільки вона дозволяє виявляти ділянки геномів, притаманні для генів стійкості. Для RGAP використовували дев’ять праймерів до послідовностей генів стійкості до цист нематод у гексаплоїдної пшениці (ген Cre3), Xanthomonas oryzae pv. oryzae у рису (ген Xa21), Pseudomonas syringae у арабідопсису (ген RPS2). Праймери були комплементарні до ділянок, які кодують повтори, багаті на лейцин та кіназні домени. Ці праймери комбінували у пари, так, що в одній парі могли опинитись праймери до різних кодувальних ділянок, різних генів стійкості, одночасно два правих чи два лівих праймера. В складі геномів ідентифіковано ділянки, характерні для генів Pm2, Pm3, Pm4b, Pm8, Pm21, Pm41. Послідовності Pm24 не виявлено. Сиксенс, розміщений у базі даних, отриманий з китайського місцевого зразку, тому ген може бути відсутній у рослин з європейської частини континенту або ж послідовності, до яких створені праймери, зазнали змін. Мінливість за дослідними ділянками була у наявності або відсутності конкретної ділянки у геномі. Найбільшу варіабельність отримано з праймерами, які створені до LRR- кодувальних послідовностей Pm3, що узгоджується з літературними даними та проведеним біоінформатичним дослідженням сиквенсів. В цьому випадку поліморфізм полягав у присутності / відсутності мінорних компонентів у електрофоретичному спектрі, які мали більшу рухливість у електричному полі, порівняно з основним компонентом. Послідовності перелічених генів виявлені у складі як стійких, так і уражених генотипів. З використанням методики RGAP отримано багатокомпонентні та поліморфні спектри. Різниця між генотипами знайдена з використанням праймерів до послідовностей, які кодують лейцинові повтори, домен NB-ARC, домен з протеїнкіназною активністю. Через аналіз контрастних генотипів за молекулярною організацією генів стійкості, за представленістю цільових ділянок були відібрані комбінації праймерів, які дозволили відрізнити батьківські генотипи та в подальшому аналізувати гібридні популяції, створені за їхньою участю. Показано, що інтрогресивні лінії відрізняються за кількістю електрофоретичних компонентів від Авротіки. Спектри лінії мають більшу кількість компонентів. Це може свідчити про різну кількість послідовностей геному Т, які отримали лінії, або перебудовами пшеничних субгеномів, які міг викликати чужинний хроматин. Відмінність у спектрах Авротіки та ліній не впливає на опірність патогенові. З метою збільшення інструментальної бази для дослідження рослин об’єднували у пари праймери, створені до Pm, як це робили при використанні техніки поліморфізму аналогів генів стійкості. Оскільки була знайдена різниця між генотипами з праймерами, створеними до ділянок, які кодують LRR, нуклеотидозв’язувальний домен та кіназні домени, то створювали пари так, щоб хоча би один з праймерів був створений до цих ділянок. Такий підхід дозволив ідентифікувати варіабельність за ділянками, характерними для гена Pm2. Через поєднання технік аналізу поліморфізму аналогів генів стійкості та групового аналізу популяцій вивчали популяції, які розщеплюються за дослідною ознакою. Гібриди, об’єднували у групи, базуючись на їхньому спільному походженні – інтрогресивній лінії, з якою отримано гібриди. Аналізували дві контрастні групи. В одну групу об’єднували ДНК від стійких генотипів (ліній, стійких гібридів), в іншу – від чутливих (сортів, чутливих гібридів). Отримали три покоління гібридів, частина з яких втрачала стійкість у поколіннях, тому ДНК від таких рослин не включали в групи. З рослинним матеріалом, який потенційно може мати генетичний матеріал від Авродесу, між контрастними групами знайдена варіабельність з праймерами, створеними до LRR. У випадку Аврозису та Авротіки – з NB-ARC та праймерами до ділянок, які кодують домени з протеїнкіназною активністю. Поведінку хроматину чужинного походження та його вплив на пшеничний геном було вивчено і під час мейотичного поділу, який визначає, який хроматин потрапить до складу гамет, які залучаються у запилення. Так само впливатиме і поєднання гамет. Наявність інтрогресій під час вивчення чавлених препаратів материнських клітин пилку спостерігали як наявність хромосомних асоціацій відмінних від закритих біваленентів – унівалентів, відкритих бівалентів та мультивалентів (тривалентів та квадривалентів). Сорти пшениці м’якої є цитологічно стабільними, у складі метафазної пластинки мають 21 закритий бівалент. МКП сорту пшениці м’якої Аврора могли утворювати 1-2 відкритих біваленти через наявність житньої транслокації 1BL·1RS у геномі сорту. МКП Авротіки мали всі згадані типи хромосом, проте така їхня поведінка у мейозі не впливає на прояв ознаки на рівні рослини. Поєднання в одному геномі інтрогресованого хроматину та пшеничного може впливати на кон’югацію між гомологічними ділянками, так що втрачатиметься не тільки хроматин чужинного походження. Спостерігали утворення хромосомних мостів, мікроядер, які, як і хромосоми, які не є бівалентами, будуть відставати під час руху до полюсів та можуть дати початок мікроядрам. Утворювалися і фрагменти хромосом. Відхилення від нормального поділу може бути через відсутність гомологічних ділянок між хромосомами. Мікроядра спостерігали на різних стадіях першого та другого поділу. На цитологічну стабільність впливає напрямок схрещування – гібриди, в яких материнскою рослиною була інтрогресивна лінія, мають більшу кількість мікроядер у тетрадах, порівняно з реципроками. Хроматин, який відходить від загальної хромосомної маси буде втрачений під час поділу, що спостерігали на стадії тетрад – частина мікроядер відокремлювалася разом з цитоплазмою. Можливо, так відбувається стабілізація гібридного геному. Вивчення рослинного матеріалу з інтрогресіями проведено через молекулярний аналіз генотипів за консервативними послідовностями, характерними для генів стійкості до патогенів та через аналіз поведінки хромосом у гібридних геномах. Поєднання молекулярного та цитологічного підходів забезпечило вивчення, як соматичної частини рослини через аналіз нуклеотидних послідовностей, так і генеративної (вивчення мейозу). Спостереження кон’югації хромосом у мейозі дозволило прослідкувати поведінку хроматину різного походження, об’єднаного у одному геномі. В подальшому це дозволить поєднати результати, отримані через вивчення нуклеотидних послідовностей генів стійкості та визначати, чи є вони у складі основних ядер клітин, які проходять поділ, чи елімінуються.Item Дослідження особливості взаємодії івермектину з тубуліном грибного та рослинного походження : дисертація на здобуття наукового ступеня доктора філософії(2025) Кустовський, Євген; Ємець, АллаДисертація на здобуття ступеня доктора філософії в галузі знань 09 "Біологія" за спеціальністю 091 "Біологія". – Національний університет "Києво-Могилянська академія", Київ, 2025. Івермектин є нематоцидом та інсектицидом, активність якого реалізується через зв’язування з Cys-петльовими рецепторами безхребетних. Окрім Cys-петльових рецепторів, відомо про взаємодії івермектину з іншими молекулярними мішенями: фарнезоїдним Х-рецептором, рецептором епідермального фактору росту, α/β-імпортином, NS3 геліказою тощо. Ідентифікація нових мішеней івермектину є підставою для переосмислення можливостей його застосування. До нещодавно встановлених мішеней івермектину належить β-тубулін – консервативний білок еукаріотичних організмів. Гетеродимери α- та β-тубуліну є структурними компонентами мікротрубочок, які є частиною цитоскелету, необхідного для функціонування еукаріотичних клітин. Мікротрубочки забезпечують транспорт органел, синтез клітинної стінки, клітинний поділ тощо. Все це робить α- та β-тубулін мішенню для багатьох лігандів, які через зв'язування з різними сайтами спричиняють стабілізацію або дестабілізацію мікротрубочок, порушуючи клітинний цикл. Наразі відомо про зв’язування івермектину з β-тубуліном нематоди Haemonchus contortus, що призводить до стабілізації мікротрубочок цієї нематоди. Водночас консервативність амінокислотних послідовностей тубуліну еукаріотичних організмів дозволяє припустити, що івермектин може також зв’язуватися з β-тубуліном рослинного та грибного походження, cтабілізуючи мікротрубочки у клітинах рослин та грибів. Дослідження взаємодії івермектину з рослинним та грибним β-тубуліном дозволить оцінити потенціал івермектину як можливого засобу для захисту рослин від грибних патогенів, а також покращити розуміння загрози від застосування івермектину для нецільових організмів. Враховуючи це, дисертаційне дослідження було присвячене вивченню взаємодії івермектину з β-тубуліном рослин і грибів та її наслідків на клітинному та організмовому рівнях. Для вивчення впливу івермектину на вищі рослин як модельний об’єкт було використано дикий тип Arabidopsis thaliana L. (екотип Col-1). У результаті in vitro експериментів було встановлено спричинені івермектином зміни у морфо-фізіологічних параметрах проростків A. thaliana. Зокрема, при вирощуванні проростків A. thaliana на середовищі, що містило івермектин у концентраціях 250 та 500 мкг/мл, спостерігали зменшення загальної довжини проростків та довжини їхніх коренів на 6-ту та 12-ту добу вирощування. Враховуючи, що найбільших змін зазнали корені проростків, було порівняно морфологічні властивості коренів 12-денних проростків у контролі та при вирощуванні на середовищі з івермектином. У результаті було встановлено, що івермектин спричинив сповільнення росту бічних коренів, вкорочення зони елонгації головного кореня, викривлення головного кореня, а також вкорочення та деформацію кореневих волосків. Для пояснення спричинених івермектином морфо-фізіологічних змін у проростків дикого типу A. thaliana було вивчено вплив івермектину на структурно-просторову організацію мікротрубочок клітин головного кореня за використання трансгенних ліній A. thaliana GFP-MAP4 та GFP-TUA6, що експресують химерні гени MAP4 та TUA6, злиті з репортерним геном GFP. У результаті було встановлено, що івермектин у концентрації 250 мкг/мл спричиняє порушення у організації мікротрубочок після 1 та 2 годин обробки; за концентрацій 50 та 100 мкг/мл не спостерігали змін у організації мікротрубочок. Також клітини різних зон кореня мали різну чутливість до дії івермектину: найчутливішими були клітини зони кореневого апексу, перехідної зони та зони елонгації, а найменш чутливими – клітини зони диференціації та кореневі волоски. У чутливих до івермектину клітин спостерігали фрагментацію та вкорочення мікротрубочок, втрату ними орієнтацій, а також виникнення коротких пучків мікротрубочок. Нами було вивчено чутливість фітопатогенних штамів Fusarium graminearum Schwabe (F-55644, F-55748, F-55756) та F. oxysporum Schltdl. (F-52897, F-54635, F-55547, f. sp. lycopersici) до івермектину. Вибір штамів був пов’язаний з тим, що вони є небезпечними патогенами, які вражають зернові та овочеві культури, знижуючи врожайність, а також якість та безпечність агропродукції. У результаті in vitro експериментів було встановлено, що івермектин є токсичним для колоній наведених штамів за концентрацій 2 та 3 мг/мл. Антигрибна активність івермектину не проявлялася за нижчих концентрацій: 0,25; 0,5; та 1 мг/мл. Серед досліджених штамів найчутливішими до івермектину були штами F. graminearum F-55748 та F. oxysporum f. sp. lycopersici, площа колоній яких на 7-му добу вирощування на середовищі з 3 мг/мл івермектину становила менше 50% від площ колоній у контролі. Найменш чутливими до івермектину були штами F. graminearum F-55644 та F-55756. Водночас у колоній цих штамів внаслідок впливу івермектину відбулися фізіологічні зміни: втрата міцелієм кольору та зменшення площі поверхневого міцелію, що також спостерігали у штамів F. oxysporum F-54635 та f. sp. lycopersici. Перед моделюванням взаємодії івермектину та β1-тубуліну A. thaliana, F. graminearum, F. oxysporum та H. contortus (використаний як контроль) порівняли амінокислотні послідовності та конформаційні властивості β-тубуліну цих організмів. Спочатку було зроблено множинне вирівнювання послідовностей β1-тубуліну A. thaliana, F. graminearum, F. oxysporum та H. contortus та порівняно ідентичність та подібність послідовностей загалом та у ділянках елементів вторинної структури таксанового сайту, з яким зв’язується івермектин. У результаті було встановлено, що послідовності β1-тубуліну F. graminearum та F. oxysporum є повністю ідентичними, а тому для моделювання взаємодії було використано лише модель β1-тубуліну F. graminearum. Також було визначено, що послідовності β1-тубуліну A. thaliana та H. contortus є консервативними на 91%, послідовності β1-тубуліну A. thaliana та F. graminearum/F. oxysporum – на 88%, а послідовності β1-тубуліну H. contortus та F. graminearum/F. oxysporum – на 89%. Серед елементів вторинної структури таксанового сайту найбільшу консервативність мала послідовність H1. Найбільші відмінності у послідовностях спостерігали у невпорядкованих петльових ділянок таксанового сайту, а саме М-петлі та S9-S10. У подальшому було проведено молекулярно-динамічні симуляції вільного β1-тубуліну A. thaliana, F. graminearum/F. oxysporum та H. contortus. Аналіз отриманих траєкторій передбачав встановлення інтервалу траєкторій, у якому знаходяться конформації рівноважного стану β1-тубуліну та відбір конформацій з оптимальним розкриттям сайту зв’язування для проведення молекулярного докінгу івермектину. Досягнення структурами рівноважного стану після 40 нс було визначено на підставі результатів аналізу часових змін середньоквадратичного відхилення важких атомів від початкової структури та кількості водневих зв’язків. У результаті кластерного аналізу конформацій таксанового сайту β-тубуліну було ідентифіковано конформації, які характеризуються найбільшим об’ємом порожнини сайту та оптимальним положенням бічних ланцюгів залишків для моделювання зв’язування івермектину. Ці конформації було використано для проведення молекулярного докінгу івермектину. Модель зв’язування івермектину з таксановим сайтом β-тубуліну була розроблена з урахуванням взаємодій івермектину з його відомими мішенями. Зокрема, нами було проаналізовано комплекси івермектину та α-гомопентамерного глутамат-хлоридного рецептора Caenorhabditis elegans, порівняно фізико-хімічні властивості сайтів зв’язування та встановлено патерни алостеричної взаємодії івермектину. Відповідно до запропонованого положення івермектину у таксановому сайті β-тубуліну бензофуранова група івермектину знаходиться у меншій за об’ємом субпорожнині сайту (утворена такими елементами структури як H1, H7 та S9-S10). Макроциклічне кільце та спірокетальна група розташовані в більшій за об’ємом, переважно гідрофобній, субпорожнині сайту (H6, H6-H7, S7, H7 та M-петлі). Гнучка та полярна дисахаридна група розташована за межами цих двох порожнин та відіграє другорядну роль у взаємодії IVM з β1-тубуліном. Стабільність комплексів івермектину та β1-тубуліну A. thaliana, F. graminearum/F. oxysporum та H. contortus було перевірено за допомогою молекулярно-динамічних симуляцій. У результаті MM/PBSA розрахунків було встановлено, що івермектин мав найбільшу афінність до β1-тубуліну A. thaliana, енергія зв’язування з яким становила -12,26±3,33 ккал/моль; нижчу афінність івермектин мав до β1-тубуліну F. graminearum/F. oxysporum (-11,30±5,20 ккал/моль); найнижчу афінність івермектин мав до β1-тубуліну H. contortus (-9,05±5,32 ккал/моль). Для визначення залишків, що мають найбільший внесок у афінність комплексів, було виконано енергетичну декомпозицію загальної енергії зв’язування та проведено аналіз стійкості водневих зв’язків між івермектином та β1-тубуліном. Було встановлено, що взаємодії з залишками у положеннях 27 у H1, 225(224), 228(227) у H7, 277(276) у M-петлі, 319(318) у S8, 360(359) та 362(361) у S9-S10 є найважливішими для підтримання стабільності комплексів. Також здійснили порівняльний аналіз конформаційних властивостей елементів структури таксанового сайту у вільному та зв’язаному з івермектином стані та встановили, що взаємодія івермeктину з β-тубуліном призводить до стабілізації М-петлі. Оскільки стабілізація мікротрубочок лігандами таксанового сайту опосередкована конформаційними змінами М-петлі, було зроблено висновок про можливість стабілізуючого впливу івермектину на мікротрубочки A. thaliana. Це було підтверджено результатами експериментів з вивчення впливу івермектину на структурно-просторову організацію та орієнтацію мікротрубочок у клітинах кореня A. thaliana GFP-MAP4 та GFP-TUA6. Таким чином, у результаті дисертаційного дослідження було вперше визначено структурно-функціональні особливості взаємодії івермектину з β-тубуліном вищих рослин (A. thaliana) та грибів (F. graminearum/F. oxysporum), виявлено зміни у організації мікротрубочок клітин кореня A. thaliana внаслідок дії івермектину, а також його вплив на розвиток A. thaliana, F. graminearum та F. oxysporum. Верифіковано стабільність комплексів івермектину та β1-тубуліну A. thaliana та F. graminearum/F. oxysporum. Отримані дані можуть бути використані для подальшого вивчення взаємодії івермектину з тубуліном інших еукаріотичних організмів, а також для пошуку нових ефективних біологічно активних сполук з високою афінністю до таксанового сайту β-тубуліну.Item Білкові фактори формування оксидативного статусу за хронічної хвороби нирок : дисертація на здобуття наукового ступеня доктора філософії(2023) Васильченко, Вікторія; Кучменко, ОленаДисертація на здобуття наукового ступеня доктора філософії за спеціальністю 091 – Біологія. – Національний університет "Києво-Могилянська академія", 2023. Дисертація присвячена дослідженню оксидативного статусу, особливостей його змін за хронічної хвороби нирок. Перші стадії хронічної хвороби нирок зазвичай не мають специфічних симптомів, тому це ускладнює їхнє визначення та спостереження за ними. Традиційні маркери дисфункції нирок, такі як креатинін та сечовина у плазмі та сечі, можуть знаходитися у межах референтних значень фізіологічного діапазону не зважаючи на погіршення ниркових функцій. Сукупність патологічних змін за хронічної хвороби нирок можна умовно поділити на три категорії: дисліпідемію, протеїнурію, а також уремію. Важливо зазначити, що існує взаємозв’язок між усіма цими компонентами та їхнім впливом один на одного. Зміна маркерів оксидативного статусу за хронічної хвороби нирок є доповнюючою інформацією про складники про- та антиоксидантної систем, їхній взаємозв’язок між собою та вплив на них інших факторів. Поглиблення розуміння окисно-відновних процесів та механізмів розвитку хронічної хвороби нирок завдяки детектуванню оксидативного статусу може сприяти покращенню не лише ранній діагностиці, а й моніторингу пацієнтів з наявними нирковими патологіями. Метою роботи було вивчення білкових факторів формування оксидативного статусу за хронічної хвороби нирок. Для реалізаційї мети застосовувались такі методи: аналіз та систематизація літературних, наукових, методичних та інших джерел з досліджуваної теми; біохімічні методи досліджень; методи статистичної обробки результатів та математичного моделювання. Зразки венозної крові для дослідження білкових факторів оксидативного статусу були взяті у 417 пацієнтів (214 жінки та 203 чоловіка, вік – 18-55 років) із хронічною хворобою нирок I-V стадії (гломерулонефрит). Усі пацієнти без гострих супутніх патологій (n=250) були розподілені на три групи: 1 групу сформували пацієнти з хронічною хворобою нирок І-ІІ стадій (n=53); 2 групу склали пацієнти з хронічною хворобою нирок ІІІ-ІV стадій (n=25); 3 група – це пацієнти з хронічною хворобою нирок V стадії (n=150). Контрольну групу склали 29 здорових осіб того ж віку з аналогічним співвідношенням статей. Усі учасники дали письмову згоду брати участь у дослідженні. Протокол дослідження (№ 7 30.08.2016) був затверджений Комісією з біоетики Інституту нефрології НАМНУ, а також протоколи дослідження тотожні дисертаційному проєкту (№ 6 від 10.06.2021 та №3 від 19.03.2023 року) були затверджені комітетом з етики наукових досліджень Національного університету "Києво-Могилянська академія". Дослідженнями біологічного матеріалу, сироватки та сечі, пацієнтів з хронічною хворобою нирок та умовно здорових донорів, з метою визначення зміни оксидативного статусу, мною було встановлено, що інвазивні та неінвазивні показники якісних та кількісних змін доповнюють традиційні маркери ниркових захворювань з деталізацією їх перебігу. Також було показано, що порушення обміну ліпопротеїнів збігається або може передувати хронічній хворобі нирок. Пероксидне окиснення ліпідів за хронічної хвороби нирок, у свою чергу, може передувати цьому захворюванню та характеризуватися утворенням реактивних альдегідів, які реагують з тіобарбітуровою кислотою. Окиснення білків у складі ліпопротеїнів високої та низької густини є причиною розвитку багатьох патологічних станів, зокрема артеріальної гіпертензії, яка є частим ускладненням хронічної хвороби нирок та інших патологій, таких як цукровий діабет та хронічні запальні процеси. У дослідженні були отримані нові дані про підвищення активності ензимів, які формують оксидативний статус, мієлопероксидази та еластази, які індукують оксидативний стрес. Крім того, спостерігалося значне зростання кількісного вмісту уремічного токсину, індоксил сульфату, оксалової кислоти та вмісту цитруліну одночасно зі зниженням активності антиоксидатного ензиму, параоксонази-1, за хронічної хвороби нирок. Вперше розраховане співвідношення між про- та антиоксидатним ензимами та проведений ґрунтовний кореляційний аналіз між потенційними та традиційними маркерами хвонічної хвороби нирок. Отримані нові дані сприяють деталізації інформації щодо потенційних маркерів хронічної хвороби нирок (цитруліну, індоксил сульфату, параоксонази-1, мієлопреоксидази та еластази). Вперше проаналізовано та продемонстровано співзалежності між ними, що дає можливість виокремити неінвазивні маркери ранніх стадій хронічної хвороби нирок, цитрулін та індоксил сульфат. Отримані нами дані про оксидативний статус підтверджує зростання активності ензимів прооксидантної ланки, як наслідок, виникнення оксидативного стресу у цієї категорії пацієнтів. Зміни оксидативного статусу можуть передувати змінам концентрації креатиніну та сечовини у плазмі та сечі, оскільки їхнє визначення може бути ускладнено відмінним раціоном або збільшенням ваги тіла. Зокрема, вміст індоксил сульфату як маркера уремії та цитруліну як маркера протеїнурії за хронічної хвороби нирок мали більший діапазон значень та чітке їхнє однонаправлене зростання із постадійним прогресуванням хронічної хвороби нирок. Таким чином, аналіз маркерів оксидативного статусу дає змогу стверджувати перспективність застосування неінвазивних маркерів задля раннього діагностування та прогресування хронічної хвороби нирок.Item Альвеолярний епітелій і рак легені (цитологічні дослідження) : дисертація на здобуття наукового ступеня доктора філософії(2023) Пономаренко, Анна; Білько, Надія; Болгова, ЛідіяДисертація на здобуття наукового ступеня PhD в галузі біології за спеціальністю 091 "Біологія", галузь знань 09 "Біологія". − Національний університет "Києво-Могилянська академія", Київ, 2023. Робота присвячена вивченню розповсюдження пухлинних клітин по паренхімі легені та дослідженню морфологічних змін альвеолярного епітелію ІІ типу у разі недрібноклітинного раку легені шляхом використання сучасних морфологічних методів дослідження. За даними Національного канцер-реєстру рак легені за частотою онкологічної захворюваності є одним з найпоширеніших серед чоловіків в Україні та в світі. В Україні, відповідно до уточнених даних Бюлетня Національного канцер-реєстру України №23, у 2020 році захворіла на рак легені 10351 людина, а померло 8339 осіб. Згідно реєстру Globocan у всьому світі в 2020 р. захворіло на рак легені 2,1 млн, а померло 1,7 млн осіб. Рак легені посідає перше місце за оцінкою смертності серед десяти найпоширеніших типів раку серед осіб обох статей. РЛ посідає перше місце за оцінкою смертності серед десяти найпоширеніших типів раку серед осіб чоловічої статі. Ці показники вказують про необхідність вивчення питань ранньої діагностики, профілактики і лікування новоутворень легені. Питання розвитку і розповсюдження раку легені по паренхімі до цього часу не висвітлено в достатній мірі в джерелах вітчизняної і зарубіжної літератури. Дослідники показують імовірне залучення різних клітинних популяцій в розвиток патології раку легені. Ряд вчених висловлюють припущення про наявність як у центральних так і у периферичних відділах легені так званих бронхіоло-альвеолярних ніш, в яких розміщуються стовбурові клітини, що відповідають за регенерацію легеневої тканини і можуть бути залучені в процес злоякісної трансформації. Результати цитологічних та імуноцитохімічних досліджень, проведених на препаратах шкребків з розрізу макроскопічно незміненої паренхіми легені на різній відстані від периферичного краю видаленої під час операції ракової пухлини, вказують на високу проліферативну активність альвеолярного епітелію ІІ типу під час розвитку злоякісної трансформації у легеневій паренхімі, що може свідчити про можливу участь цих клітин у розвитку злоякісної трансформації. Поряд з цим, експериментальні дослідження не містять інформації щодо розповсюдження пухлинних клітин по паренхімі легені. В джерелах літератури наведено результати робіт вчених, які вказують на можливість розповсюдження пухлинних клітин через повітряні шляхи. Натомість, інші автори, спираючись на результати власних гістологічних та гістохімічних досліджень, показують можливість розвитку раку легені з-під слизової оболонки бронха. Такі результати свідчать про невизначеність багатьох проблем вказаної патології. До цього часу немає єдиної думки щодо стовбурової клітини легені. Існують різні погляди на джерело розвитку і розповсюдженість пухлинних клітин по легені. Зовсім не вивчено зміни альвеолярних клітин в паренхімі легені, видаленої під час оперативного втручання пухлини. В той же час є дані, що альвеолярний епітелій ІІ типу може бути стовбуровою клітиною, а відтак складається не вивчена проблема змін альвеолярного епітелію ІІ типу, вивчення якої може пролити світло на характер росту і розповсюдженість клітин недрібноклітинного раку легені. Це має пряме відношення для визначення характеру малігнізації клітин альвеолярного епітелію ІІ типу і пояснити можливість поширення і розвитку самого процесу раку легені. Таким чином, питання гістогенезу раку легені залишається відкритим, а дослідження проблеми розповсюдження раку легені по паренхімі сприятиме уточненню можливої пролонгації патологічного процесу. В дисертаційному дослідженні отримані оригінальні дані, які не зустрічаються у Вітчизняній і зарубіжній літературі. Метою дисертаційної роботи є визначити розповсюдженість пухлинних клітин і клітин альвеолярного епітелію ІІ типу з ознаками проліферації і атипії на різній відстані від новоутворення в макроскопічно незміненій, видаленій з пухлиною паренхімі легені. Для досягнення мети сформульовані наступні завдання: 1. Визначити наявність пухлинних клітин недрібноклітинного раку в паренхімі легені поряд з периферичним краєм видаленої ракової пухлини. 2. Виявити зміни в альвеолярному епітелії ІІ типу поряд з краєм пухлинного вузла, видаленого в процесі оперативного втручання. 3. Установити наявність пухлинних клітин недрібноклітинного раку на відстані 2 см від перферичного краю видаленої новоутворення. 4. Визначити наявність і зміни клітин альвеолярного епітелію ІІ типу на відстані 2 см від периферичного краю видаленої пухлини. 5. Вивчити наявність пухлинних клітин недрібноклітинного раку на відстані 5 см від периферичного краю новоутворення. 6. Визначити і зміни клітин альвеолярного епітелію ІІ типу на відстані 2 см від периферичного краю видаленої пухлини. 7. Проаналізувати наявність пухлинних клітин недрібноклітинного раку легені та за допомогою імуноцитохімічних реакцій з використанням наступних моноклональних антитіл: фактора транскрипції щитоподібної залози-1 (TTF-1), маркеру проліферації Ki-67 (Кі-67), пухлинного протеїну р53 (p53), аспартичної протеази (Napsin-А), кератину ІІ цитоскелетного 7 (Cytokeratin-7) на цитологічних препаратах з розрізів легеневої паренхіми на різних відстанях від пухлини. 8. Провести аналіз отриманих даних з використанням програми MS Excel за t-критерієм Стьюдента. Статистичну обробку проводили з використанням пакету MS Excel для оцінки кількісних цитологічних показників шляхом розрахунку середнього значення показника (M) та його стандартної похибки (m) та використовуючи t-критерій Стьюдента з критичним рівнем значимості у всіх статистичних тестах (p<0,05). Було показано, що кількість пухлинних клітин в паренхімі легені поряд з периферичним краєм видаленої ракової пухлини у разі залозистого раку склала (59±9,8), у разі аденосквамозного раку аналогічний показник склав (65±7,1), у випадках плоскоклітинного кількість пухлинних клітин склала (74±8,4). Числове значення наявності клітин альвеолярного епітелію ІІ типу зі змінами в ділянці периферичного краю новоутворення незалежно від гістологічного типу склало (32±8,7). Кількість альвеолярного епітелію з ознаками проліферації і атипії в ділянці периферичного краю новоутворення у разі залозистого раку становила (34±10,4). Квантитативна оцінка пухлинних клітин у разі аденосквамозного раку в досліджуваній ділянці склала (31±8,3). Аналогічний показник кількості пухлинних клітин у разі плоскоклітинного раку становив (31±7,5). Значення кількості пухлинних клітин в перитуморальній ділянці незалежно від гістолочного типу склала (23±3,0). Кількість пухлинних клітин в паренхімі легені в перитуморальній зоні у разі залозистого раку склала (38 ±5,0), у випадках плоскоклітинного раку аналогічний показник склав (11±2,4). Числове значення клітин альвеолярного епітелію ІІ типу з ознаками проліферації та деякої атипії в перитуморальній зоні незалежно від гістологічного типу раку легені склало (60±2,2). Кількість клітин альвеолярного епітелію з ознаками проліферації і атипії у разі залозистого раку склала (50±3,4), а у разі плоскоклітинного раку становила (76±2,7). Кількість пухлинних клітин в найбільш віддаленій зоні незалежно від гістологічного типу пухлини склала (3±1,1). У разі залозистого раку кількість пухлинних клітин в досліджуваній ділянці становила (5±1,9), а у разі плоскоклітинного (1±0,7). Числове значення клітин альвеолярного епітелію ІІ типу з ознаками проліферації та деякої атипії в найбільш віддаленій ділянці незалежно від гістологічного типу раку легені склало (55±2,4). Аналогічний показник кількості альвеолярного епітелію зі змінами у разі залозистого раку становив (58,0±3,2), а у разі плоскоклітинного раку склав (54±3,2). Маркер Cytokeratin-7 в пухлинних клітинах показав позитивну експресію у разі залозистого раку у 1 хворого в ділянці периферичного краю новоутворення та в найбільш віддаленій зоні від пухлинного вузла. У разі аденосквамозного раку в ділянці периферичного краю видаленої пухлини цей маркер мав високий рівень експресії у 2 досліджуваних хворих. У випадках плоскоклітинного раку маркер експресувався у 1 з 2 пацієнтів у ділянці периферичного краю новоутворення. Використання на пухлинних клітинах різних гістологічних типів недрібноклітинного раку легені маркерів TTF-1, Napsin-A, p53, Ki-67 не показали достатнього рівня експресії на цитологічних препаратах у досліджуваних пацієнтів. Отримані дані свідчать про різний ступінь розповсюдженості пухлинних клітин на різну відстань від пухлинного вузла, особливо у випадках ЗР. Результати проведених цитологічних та імуноцитохімічних досліджень свідчать про високий проліферативний потенціал, наростання атипії і можливу малігнізацію альвеолярного епітелію ІІ типу як поруч з пухлиною, так і різній на відстані від неї. Новизна дослідження. Вперше за допомогою цитологічного та імуноцитохімічного методів визначено наявність та проведено квантитативну оцінку пухлинних клітин недрібноклітинного раку легені на різних відстанях від пухлинного вузла. Вперше проведені дослідження, які дозволили визначити розповсюдженість клітин раку легені різної гістологічної структури по макроскопічно незміненій паренхімі поруч і на різній відстані від видаленого під час операції пухлинного вузла. Вперше застосовано новий підхід у вивченні морфологічних змін клітин альвеолярного епітелію ІІ типу – показано проліферацію і атипію та проведено квантитативний аналіз клітин альвеолярного епітелію ІІ типу на різних ділянках макроскопічно незміненої паренхіми легені, видаленій з пухлиною під час операції, що може бути опосередкованим показником можливості їх малігнізації та може опосередковано свідчити про те, що альвеолярний епітелій ІІ типу може бути стовбуровою клітиною. Ухвали біоетичних комітетів: Дана робота схвалена до виконання витягом з протоколу №201/9 засідання Комісії з питань етики Національного інституту раку від 21.11.2021 року та ухвалою Комітету з етики наукових досліджень НаУКМА протокол №2 від від 07.07.2022 року за реєстраційним номером №00030125.Item Гетерогенність гемопоетичних клітин-попередників у культурі клітин in vitro та in vivo у нормі та при мієлодиспластичному синдромі : дисертація на здобуття наукового ступеня доктора філософії(2023) Пахаренко, Маргарита; Білько, НадіяДисертація на здобуття наукового ступеня доктора філософії в галузі знань 09 "Біологія" за спеціальністю 091 "Біологія". Національний університет "Києво-Могилянська Академія", Київ, 2023. Експериментальні дані останніх років свідчать про те, що злоякісні стовбурові клітини можуть існувати як самостійні популяції відносно клітин, які знаходяться у стані спокою, і зовсім не реагують на звичайні клітинно-токсичні агенти. Відомо, що більшість стовбурових клітин у дорослому організмі перебувають у стані G0, що дозволяє клітинам довготривало перебувати у гемопоетичних нішах та у разі потреби переходити до проліферації. Завдяки знаходженню поза клітинним циклом стовбурові клітини більш стійкі до ушкоджень ДНК. Ця особливість "сплячих" стовбурових клітин дає змогу зберегти "золотий запас" від всіляких стресових подій і тим самим сприяти лікуванню. Разом з тим існує популяція гемопоетичних клітин-попередників, на рівні яких відбувається реалізація процесів проліферації і диференціювання, оскільки вони є чутливими до дії цитокінів, які викидаються у випадку нестачі клітин крові на периферії. Роль гемопоетичних клітин-попередників недооцінена, і вона виявилася вагомішою, ніж вважалося раніше. Незважаючи на те, що завдяки використанню мишиних моделей з’являється все більше доказів про існування стовбурових клітин, що ініціюють лейкемію, менш відомо про зміни на рівні компартменту стовбурових клітин у пацієнтів з мієлодиспластичним синдромом (МДС). Хоча припускається, що МДС є "захворюванням стовбурових клітин", вагомі докази цього твердження досі відсутні, крім того, лишається невідомим рівень пошкодження гемопоетичних клітин-попередників у пацієнтів із МДС, що складають цілу групу попередників, які відрізняються за відстанню їх від стовбурової клітини. Крім того, незважаючи на описані хромосомні аномалії, мутації і епігенетичні зміни при МДС, що спостерігаються в попередниках, етапи розвитку, на яких відбуваються патогенні події, ще не визначені. Для вирішення цих питань необхідні нові методичні підходи для виявлення різних типів клітин-попередників завдяки фенотипуванню і/чи культивуванню ранніх гемопоетичних клітин. Доцільність визначення морфологічних і функціональних показників гемопоетичних клітин-попередників з кісткового мозку мишей, щурів і людини обумовлена необхідністю поглиблення знань про особливості їх функціонування, вирішення питання про гетерогенність клітин-попередників у різних ссавців і людини, як загальне виявлення біологічної природи і потенцій у культурі клітин in vitro і in vivo в нормі і порушеннях гемопоезу. Тож метою дисертаційної роботи було визначення гетерогенності гемопоетичних клітин-попередників в культурі in vitro і in vivo для з’ясування іхньої ролі у формуванні патологічного процесу при МДС-IB. Щоб відповісти на ці питання, ми провели дослідження популяції прогеніторних клітин у пацієнтів з підтипом МДС-ІB. Ми вивчали культури гемопоетичних стовбурових клітин в умовах in vitro і in vivo. Вперше було виявлено гетерогенну групу типів колоній (КУО-ГЕММ, КУО-Г, КУО-ГМ і КУО-ММ), ранні представники яких (КУО-ГЕММ і КУО-Г) були притаманні саме МДС-ІВ, а пізні (КУО-ГМ і КУО-ММ) – нормальному гемопоезу. Було встановлено оптимальні терміни культивування гемопоетичних клітин-попередників для людини (12-14 діб), миші (10 діб) та щура (8 діб). Було проаналізовано відповідь прогеніторних клітин на дію підвищених доз цитокінів (G-CSF, GM-CSF, IL-3) а також їх комбінації у культурі, та виявлено, що найкращий ефект викликає саме комбінація вказаних факторів, значно підвищуючи ефективність колонієутворення. Дослідженням культуральних особливостей клітин-попередників при МДС-ІВ було продемонстровано знижену у порівнянні з нормою здатність до колонієутворення останніх, де кількість клітин у клоні не перевищувала 50, а у нормі – 500. Крім того, якісний склад колоній характеризувався наявністю хаотично розміщених примхливих форм клітин. Вперше було продемонстровано, що наявність стромальної підложки зі здорових кістковомозкових клітин не впливає на дефектність гемопоетичних клітин-попередників при МДС-ІВ. У свою чергу, фідерний шар з кістковомозкових клітин осіб з МДС здатний до підтримки гемопопетичних клітин від здорових осіб. Тож, дефекти кровотворної функції слід шукати у гемопоетичних клітинах-попередниках з урахуванням їх гетерогенності. У майбутньому вирішення поставлених питань сприятиме у підборі тактики лікування злоякісних захворювань крові, серед яких МДС має особливе місце, як захворювання, що з високою імовірністю може переростати у гостру мієлоїдну лейкемію. Результати роботи можна рекомендувати для експериментальних досліджень МДС-ІВ. Отримані у культурі дані про МДС-ІВ можуть у комбінації з клінічними, цитогенетичним, лабораторними та імунофенотиповими даними слугувати додатковою ознакою при постановці діагнозу МДС у ініціальній стадії.