Гетерогенність гемопоетичних клітин-попередників у культурі клітин in vitro та in vivo у нормі та при мієлодиспластичному синдромі : дисертація на здобуття наукового ступеня доктора філософії
Loading...
Date
2023
Authors
Пахаренко, Маргарита
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора філософії в галузі знань 09 "Біологія" за спеціальністю 091 "Біологія". Національний університет "Києво-Могилянська Академія", Київ, 2023. Експериментальні дані останніх років свідчать про те, що злоякісні стовбурові клітини можуть існувати як самостійні популяції відносно клітин, які знаходяться у стані спокою, і зовсім не реагують на звичайні клітинно-токсичні агенти. Відомо, що більшість стовбурових клітин у дорослому організмі перебувають у стані G0, що дозволяє клітинам довготривало перебувати у гемопоетичних нішах та у разі потреби переходити до проліферації. Завдяки знаходженню поза клітинним циклом стовбурові клітини більш стійкі до ушкоджень ДНК. Ця особливість "сплячих" стовбурових клітин дає змогу зберегти "золотий запас" від всіляких стресових подій і тим самим сприяти лікуванню. Разом з тим існує популяція гемопоетичних клітин-попередників, на рівні яких відбувається реалізація процесів проліферації і диференціювання, оскільки вони є чутливими до дії цитокінів, які викидаються у випадку нестачі клітин крові на периферії. Роль гемопоетичних клітин-попередників недооцінена, і вона виявилася вагомішою, ніж вважалося раніше. Незважаючи на те, що завдяки використанню мишиних моделей з’являється все більше доказів про існування стовбурових клітин, що ініціюють лейкемію, менш відомо про зміни на рівні компартменту стовбурових клітин у пацієнтів з мієлодиспластичним синдромом (МДС). Хоча припускається, що МДС є "захворюванням стовбурових клітин", вагомі докази цього твердження досі відсутні, крім того, лишається невідомим рівень пошкодження гемопоетичних клітин-попередників у пацієнтів із МДС, що складають цілу групу попередників, які відрізняються за відстанню їх від стовбурової клітини. Крім того, незважаючи на описані хромосомні аномалії, мутації і епігенетичні зміни при МДС, що спостерігаються в попередниках, етапи розвитку, на яких відбуваються патогенні події, ще не визначені. Для вирішення цих питань необхідні нові методичні підходи для виявлення різних типів клітин-попередників завдяки фенотипуванню і/чи культивуванню ранніх гемопоетичних клітин. Доцільність визначення морфологічних і функціональних показників гемопоетичних клітин-попередників з кісткового мозку мишей, щурів і людини обумовлена необхідністю поглиблення знань про особливості їх функціонування, вирішення питання про гетерогенність клітин-попередників у різних ссавців і людини, як загальне виявлення біологічної природи і потенцій у культурі клітин in vitro і in vivo в нормі і порушеннях гемопоезу. Тож метою дисертаційної роботи було визначення гетерогенності гемопоетичних клітин-попередників в культурі in vitro і in vivo для з’ясування іхньої ролі у формуванні патологічного процесу при МДС-IB. Щоб відповісти на ці питання, ми провели дослідження популяції прогеніторних клітин у пацієнтів з підтипом МДС-ІB. Ми вивчали культури гемопоетичних стовбурових клітин в умовах in vitro і in vivo. Вперше було виявлено гетерогенну групу типів колоній (КУО-ГЕММ, КУО-Г, КУО-ГМ і КУО-ММ), ранні представники яких (КУО-ГЕММ і КУО-Г) були притаманні саме МДС-ІВ, а пізні (КУО-ГМ і КУО-ММ) – нормальному гемопоезу. Було встановлено оптимальні терміни культивування гемопоетичних клітин-попередників для людини (12-14 діб), миші (10 діб) та щура (8 діб). Було проаналізовано відповідь прогеніторних клітин на дію підвищених доз цитокінів (G-CSF, GM-CSF, IL-3) а також їх комбінації у культурі, та виявлено, що
найкращий ефект викликає саме комбінація вказаних факторів, значно підвищуючи ефективність колонієутворення. Дослідженням культуральних особливостей клітин-попередників при МДС-ІВ було продемонстровано знижену у порівнянні з нормою здатність до колонієутворення останніх, де кількість клітин у клоні не перевищувала 50, а у нормі – 500. Крім того, якісний склад колоній характеризувався наявністю хаотично розміщених примхливих форм клітин. Вперше було продемонстровано, що наявність стромальної підложки зі здорових кістковомозкових клітин не впливає на дефектність гемопоетичних клітин-попередників при МДС-ІВ. У свою чергу, фідерний шар з
кістковомозкових клітин осіб з МДС здатний до підтримки гемопопетичних клітин від здорових осіб. Тож, дефекти кровотворної функції слід шукати у гемопоетичних клітинах-попередниках з урахуванням їх гетерогенності. У майбутньому вирішення поставлених питань сприятиме у підборі тактики лікування злоякісних захворювань крові, серед яких МДС має особливе місце, як захворювання, що з високою імовірністю може переростати у гостру мієлоїдну лейкемію. Результати роботи можна рекомендувати для експериментальних досліджень МДС-ІВ. Отримані у культурі дані про МДС-ІВ можуть у комбінації з клінічними, цитогенетичним, лабораторними та імунофенотиповими даними слугувати додатковою ознакою при постановці діагнозу МДС у ініціальній стадії.
Description
Thesis for the degree of Doctor of Philosophy in the field of knowledge 09 "Biology" in the speciality 091 "Biology". National University of "Kyiv-Mohyla Academy", Kyiv, 2023. Experimental data from recent years suggest that malignant stem cells can exist as independent populations relative to cells that are at rest and do not respond at all to conventional cellular toxic agents. It is known that most stem cells in an adult organism are in the G0 state, which allows cells to stay in hematopoietic niches for a long time and, if necessary, proceed to proliferation. Due to being outside the cell cycle, stem cells are more resistant to DNA damage. This feature of "dormant" stem cells makes it possible to preserve the "gold reserve" from all sorts of stressful events and thereby promote treatment. At the same time, there is a population of hematopoietic progenitor cells, at the level of which the processes of proliferation and differentiation occur, since they are sensitive to the action of cytokines, which are ejected in the event of a shortage of blood cells in the periphery. The role of hematopoietic progenitor cells is underestimated, and it turned out to be more significant than previously thought. Although more evidence of leukemia-initiating stem cells is emerging through the use of mouse models, less is known about changes at the level of stem cell compartment in patients with myelodysplastic syndrome (MDS). Although it is assumed that MDS is a "stem cell disease", there is still no strong evidence of this statement, in addition, the level of damage to hematopoietic progenitor cells in patients with MDS, which constitute a whole group of progenitors that differ in their distance from the stem cell, remains unknown. In addition, despite the described chromosomal abnormalities, mutations and epigenetic changes in MDS observed in progenitors, the stages of development at which pathogenic events occur have not yet been determined. To solve these issues, new methodological approaches are needed to identify different types of progenitor cells and solve questions that can be answered through phenotyping and/or culturing early hematopoietic cells. The expediency of determining the morphological and functional parameters of hematopoietic progenitor cells from the bone marrow of mice, rats and humans is due
to the need to deepen knowledge about the peculiarities of their functioning, to address the issue of heterogeneity of progenitor cells in different mammals and humans, as a general identification of the biological nature and potentials in cell culture in vitro and in vivo in normal and disorders of hematopoiesis. Therefore, the aim of the dissertation was to determine the heterogeneity of hematopoietic progenitor cells in vitro and in vivo to clarify their role in the formation of the pathological process in MDS-IB. To answer these questions, we studied the population of progenitor cells in patients with MDS-IB subtype. We studied hematopoietic stem cell cultures in vitro and in vivo. For the first time, a heterogeneous group of colony types (CFU-GEMM, CFU-G, CFU-GM and CFU-MM) was identified, the early representatives of which were characteristic of MDS-IB, and the later ones – of normal hematopoiesis. The optimal terms of cultivation of hematopoietic progenitor cells for humans (12-14 days), mice (10 days) and rats (8 days) were established. The response of progenitor cells to high doses of cytokines (G-CSF, GM-CSF, IL-3) and their combination in culture was analyzed, and it was found that the combination of these factors has the best effect, significantly increasing the efficiency of colony formation. The study of the cultural characteristics of progenitor cells in MDS-IВ demonstrated a reduced ability to colony formation of the latter compared to the norm, where the number of cells in a clone did not exceed 50, and in the norm – 500. In addition, the qualitative composition of thecolonies was characterized by the presence of chaotically arranged capricious cell forms. For the first time, it was demonstrated that the presence of a stromal substrate of healthy bone marrow cells does not affect the defectiveness of hematopoietic progenitor cells in MDS-IВ. In turn, the feeder layer of bone marrow cells from individuals with MDS is capable of supporting hematopoietic cells from healthy individuals. Therefore, defects in hematopoietic function should be sought in hematopoietic progenitor cells, taking into account their heterogeneity. In the future, the resolution of these issues will help in the selection of treatment tactics for malignant blood diseases, among which MDS has a special place as a disease that is highly likely to develop into acute myeloid leukemia. The results of this work can be recommended for experimental studies of MDS-IВ. The data obtained in culture on MDS-IВ can, in combination with clinical, cytogenetic, laboratory and immunophenotypic data, serve as an additional feature in the diagnosis of MDS in the initial stage.
Keywords
гетерогенність, мієлодиспластичний синдром, метод культивування in vitro та in vivo, кінетика розвитку патологічного процесу у культурі, клітинні механізми, морфологія клітин, фактори росту, міграція клітин-попередників, клітини системи крові, гемопоез, проліферація, стовбурові клітини, кістковий мозок, мезенхіма, цитокіни, дисертація, heterogeneity, myelodysplastic syndrome, method of cultivation in vitro and in vivo, kinetics of pathological process development in culture, cell mechanisms, cell morphology, growth factors, migration of progenitor cells, blood system cells, hematopoiesis, proliferation, stem cells, bone marrow, mesenchyme, cytokines
Citation
Пахаренко М. В. Гетерогенність гемопоетичних клітин-попередників у культурі клітин in vitro та in vivo у нормі та при мієлодиспластичному синдромі : дисертація на здобуття наукового ступеня доктора філософії / Пахаренко Маргарита Вікторівна ; наук. кер.: Білько Надія Михайлівна ; Міністерство освіти і науки України, Національний університет "Києво-Могилянська академія". - Київ : [б. в.], 2023. - 131 с.