009. Наукові підрозділи НаУКМА

Permanent URI for this community

https://ekmair.ukma.edu.ua/handle/123456789/12000
У цьому фонді розміщуються колекції Докторської школи, наукової бібліотеки, навчально-наукових центрів та інших наукових підрозділів НаУКМА. Створення колекції відбувається за зверненням до віце-президента з науково-навчальних студій Ольги Полюхович (olga.poliukhovych@ukma.edu.ua).

Browse

Browsing 009. Наукові підрозділи НаУКМА by Author "Антонюк, Максим"

Now showing 1 - 3 of 3
  • Thumbnail Image
    Item
    Експресивність стійкості до борошнистої роси у інтрогресивних лініях пшениці м'якої : дисертація на здобуття наукового ступеня доктора філософії
    (2025) Плигун, Вікторія; Антонюк, Максим
    У дисертаційному дослідженні описано прояв стійкості у гібридного рослинного матеріалу, отриманого через інтрогресивну гібридизацію з залученням генетичного матеріалу ліній-похідних амфідиплоїдів (ААВВХХ), які мають геноми диплоїдних дикорослих видів (ХХ) та субгеноми А та В пшениці м’якої Аврора (ААВВDD). У роботі використано лінії Авротіки (ААВВТТ), Авродесу (ААВВSS), Аврозису (ААВВSshSsh) та Авролати (ААВВUU). Останній геном амфідиплоїдів походить від Amblyopyrum muticum Boiss. (van Slageren) (Aegilops mutica Boiss), Aegilops speltoides, Aegilops sharonensis, Aegilops umbellulata, відповідно. З використанням інтрогресивних ліній та низки сортів пшениці м’якої отримані популяції, які розщеплюються за дослідною ознакою у трьох поколіннях (F1-3). Схрещували контрастні генотипи – стійкі лінії та сорти, які уражуються патогеном. Гібриди отримані за різних напрямків схрещувань – прямого (інтрогресивна лінія була материнською рослиною) та зворотного (лінія була донором пилку для запилення сорту). Одні з гібридів, отримані через запилення стійких гібридів F2 сортом, який міг бути відмінний від того, з яким отримано материнську рослину F1. Отриманий рослинний матеріал оцінювали у польових умовах та добирали для вивчення за структурою генів ті рослини, що зберігають ознаку у поколіннях. Оцінено рослинний матеріал за ознакою стійкості – батьківські генотипи та гібриди. Серед доступних у біологічній базі даних GenBank відібрано сиквенси шести генів стійкості до борошнистої роси: Pm2, Pm3, Pm4b, Pm8, Pm21, Pm24, Pm41. Серед перерахованих, для Pm2, Pm3 та Pm24 знайдено декілька сиквенсів. В межах кожного з генів ідентифіковані відмінності: інсерції / делеції (одно-, двонуклеотидні), транзиції та трансверсії. Серед кодувальних ділянок, які мають гени, найбільше варіюють LRR кодувальні частини у Pm3. Наявність таких варіацій може впливати на амінокислотний склад білків. Ідентифікована різниця між послідовностями в межах кожного з генів є статистично недостовірною (р<0,05), що було доведено через розрахунок критерію Колмогорова – Смірнова (для Pm24) та критерію нуклеотидної різноманітності Тадзіми (для Pm2, Pm3). Проте варіювання нуклеотидного складу генів може впливати на амінокислотний склад білків стійкості та їхнє функціонування. З використанням послідовностей перерахованих генів та проведеного біоінформатичного аналізу створено 20 пар праймерів до консервативних послідовностей Pm, які кодують: Rx N-термінальний, С2, протеїнкіназоподібний, NB-ARC домени, повтори, багаті на лейцин, рослинну С-кінцеву фосфорибозилтрансферазу, каталітичний домен серин / треонінової кінази інтерлейкін-1 асоційованої рецептор-асоційованої кінази (serine/threonine kinase interleukin-1 receptor associated kinase, STKc-IRAK). Відслідковано наявність послідовностей геному, які можна пов’язати зі стійкістю, за допомогою ділянок генів стійкості, які використовували як маркерні. Проаналізовані батьківські генотипи (амфідиплоїди, лінії та сорти) з метою пошуку поліморфізму за послідовностями генів стійкості. Припускаємо, що джерелом бажаної ознаки є послідовності геному диплоїдного виду або ж ці ділянки опосередковано впливатимуть на резистентність – мають позитивний ефект на прояв дії генів, які мають пшеничні геноми. Тому вивчали і амфідиплоїди за структурою генів стійкості, щоб визначати які ділянки вони мають та які ділянки отримають генотипи, створені за їхньої участі. Для вивчення рослинного матеріалу використовували два підходи. Під час першого – аналізували з використанням праймерів, створених до Pm. Під час другого підходу послуговувалися методикою поліморфізму аналогів стійкості (RGAP), оскільки вона дозволяє виявляти ділянки геномів, притаманні для генів стійкості. Для RGAP використовували дев’ять праймерів до послідовностей генів стійкості до цист нематод у гексаплоїдної пшениці (ген Cre3), Xanthomonas oryzae pv. oryzae у рису (ген Xa21), Pseudomonas syringae у арабідопсису (ген RPS2). Праймери були комплементарні до ділянок, які кодують повтори, багаті на лейцин та кіназні домени. Ці праймери комбінували у пари, так, що в одній парі могли опинитись праймери до різних кодувальних ділянок, різних генів стійкості, одночасно два правих чи два лівих праймера. В складі геномів ідентифіковано ділянки, характерні для генів Pm2, Pm3, Pm4b, Pm8, Pm21, Pm41. Послідовності Pm24 не виявлено. Сиксенс, розміщений у базі даних, отриманий з китайського місцевого зразку, тому ген може бути відсутній у рослин з європейської частини континенту або ж послідовності, до яких створені праймери, зазнали змін. Мінливість за дослідними ділянками була у наявності або відсутності конкретної ділянки у геномі. Найбільшу варіабельність отримано з праймерами, які створені до LRR- кодувальних послідовностей Pm3, що узгоджується з літературними даними та проведеним біоінформатичним дослідженням сиквенсів. В цьому випадку поліморфізм полягав у присутності / відсутності мінорних компонентів у електрофоретичному спектрі, які мали більшу рухливість у електричному полі, порівняно з основним компонентом. Послідовності перелічених генів виявлені у складі як стійких, так і уражених генотипів. З використанням методики RGAP отримано багатокомпонентні та поліморфні спектри. Різниця між генотипами знайдена з використанням праймерів до послідовностей, які кодують лейцинові повтори, домен NB-ARC, домен з протеїнкіназною активністю. Через аналіз контрастних генотипів за молекулярною організацією генів стійкості, за представленістю цільових ділянок були відібрані комбінації праймерів, які дозволили відрізнити батьківські генотипи та в подальшому аналізувати гібридні популяції, створені за їхньою участю. Показано, що інтрогресивні лінії відрізняються за кількістю електрофоретичних компонентів від Авротіки. Спектри лінії мають більшу кількість компонентів. Це може свідчити про різну кількість послідовностей геному Т, які отримали лінії, або перебудовами пшеничних субгеномів, які міг викликати чужинний хроматин. Відмінність у спектрах Авротіки та ліній не впливає на опірність патогенові. З метою збільшення інструментальної бази для дослідження рослин об’єднували у пари праймери, створені до Pm, як це робили при використанні техніки поліморфізму аналогів генів стійкості. Оскільки була знайдена різниця між генотипами з праймерами, створеними до ділянок, які кодують LRR, нуклеотидозв’язувальний домен та кіназні домени, то створювали пари так, щоб хоча би один з праймерів був створений до цих ділянок. Такий підхід дозволив ідентифікувати варіабельність за ділянками, характерними для гена Pm2. Через поєднання технік аналізу поліморфізму аналогів генів стійкості та групового аналізу популяцій вивчали популяції, які розщеплюються за дослідною ознакою. Гібриди, об’єднували у групи, базуючись на їхньому спільному походженні – інтрогресивній лінії, з якою отримано гібриди. Аналізували дві контрастні групи. В одну групу об’єднували ДНК від стійких генотипів (ліній, стійких гібридів), в іншу – від чутливих (сортів, чутливих гібридів). Отримали три покоління гібридів, частина з яких втрачала стійкість у поколіннях, тому ДНК від таких рослин не включали в групи. З рослинним матеріалом, який потенційно може мати генетичний матеріал від Авродесу, між контрастними групами знайдена варіабельність з праймерами, створеними до LRR. У випадку Аврозису та Авротіки – з NB-ARC та праймерами до ділянок, які кодують домени з протеїнкіназною активністю. Поведінку хроматину чужинного походження та його вплив на пшеничний геном було вивчено і під час мейотичного поділу, який визначає, який хроматин потрапить до складу гамет, які залучаються у запилення. Так само впливатиме і поєднання гамет. Наявність інтрогресій під час вивчення чавлених препаратів материнських клітин пилку спостерігали як наявність хромосомних асоціацій відмінних від закритих біваленентів – унівалентів, відкритих бівалентів та мультивалентів (тривалентів та квадривалентів). Сорти пшениці м’якої є цитологічно стабільними, у складі метафазної пластинки мають 21 закритий бівалент. МКП сорту пшениці м’якої Аврора могли утворювати 1-2 відкритих біваленти через наявність житньої транслокації 1BL·1RS у геномі сорту. МКП Авротіки мали всі згадані типи хромосом, проте така їхня поведінка у мейозі не впливає на прояв ознаки на рівні рослини. Поєднання в одному геномі інтрогресованого хроматину та пшеничного може впливати на кон’югацію між гомологічними ділянками, так що втрачатиметься не тільки хроматин чужинного походження. Спостерігали утворення хромосомних мостів, мікроядер, які, як і хромосоми, які не є бівалентами, будуть відставати під час руху до полюсів та можуть дати початок мікроядрам. Утворювалися і фрагменти хромосом. Відхилення від нормального поділу може бути через відсутність гомологічних ділянок між хромосомами. Мікроядра спостерігали на різних стадіях першого та другого поділу. На цитологічну стабільність впливає напрямок схрещування – гібриди, в яких материнскою рослиною була інтрогресивна лінія, мають більшу кількість мікроядер у тетрадах, порівняно з реципроками. Хроматин, який відходить від загальної хромосомної маси буде втрачений під час поділу, що спостерігали на стадії тетрад – частина мікроядер відокремлювалася разом з цитоплазмою. Можливо, так відбувається стабілізація гібридного геному. Вивчення рослинного матеріалу з інтрогресіями проведено через молекулярний аналіз генотипів за консервативними послідовностями, характерними для генів стійкості до патогенів та через аналіз поведінки хромосом у гібридних геномах. Поєднання молекулярного та цитологічного підходів забезпечило вивчення, як соматичної частини рослини через аналіз нуклеотидних послідовностей, так і генеративної (вивчення мейозу). Спостереження кон’югації хромосом у мейозі дозволило прослідкувати поведінку хроматину різного походження, об’єднаного у одному геномі. В подальшому це дозволить поєднати результати, отримані через вивчення нуклеотидних послідовностей генів стійкості та визначати, чи є вони у складі основних ядер клітин, які проходять поділ, чи елімінуються.
  • Thumbnail Image
    Item
    Молекулярно-генетичні механізми стійкості до холодового стресу в геномно-заміщеної форми пшениці: автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук
    (2017) Єфіменко, Тетяна; Антонюк, Максим
    Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.15 – генетика. – Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Київ, 2017. В дисертації показано зв’язок характеристик кореневої системи з підвищеної зимостійкістю для амфідиплоїда Авротіка (ААВВТТ) та інтрогресивних ліній пшениці з генетичним матеріалом Т геному виду Aegilops mutica. Створені інтрогресивні лінії, що походять від схрещування сорту м’якої пшениця Аврора і амфідиплоїда Авротіка, оцінено з використанням мікросателітного аналізу щодо присутності інтрогресій у складі хромосом 5 гомеологічної групи. Показано присутність "мозаїчних" хромосом, що могли утворитися через рекомбінації геномів D і Т. Визначено, що накопичення вільного проліна та зміни проникності мембрани не належать до механізмів забезпечення підвищеної зимостійкості амфідиплоїда Авротіка. Встановлено позитивний зв’язок між об’ємом кореневої системи Авротіки та інтрогресивних ліній та виживанням рослин у польових умовах зимою. Показано, що характерний для Авротіки алель гена AGL21, продукт якого регулює синтез ауксина в коренях, переважає у рослин, що перезимували в полі, отже, може мати позитивний зв’язок з морозостійкістю рослин.
  • Thumbnail Image
    Item
    Молекулярно-генетичні механізми стійкості до холодового стресу в геномно-заміщеної форми пшениці: дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук
    (2017) Єфіменко, Тетяна; Антонюк, Максим
    В дисертаційному дослідженні показано зв’язок архітектури кореневої системи геномно-заміщеного амфідиплоїда Авротіка з його підвищеною стійкістю до низьких температур. Амфідиплоїд Авротіка містить у своєму геномі тетракомпонент (ААВВ) геному сорту пшениці Аврора (ААВВDD) і ТТ геном диплоїдного виду Aegilops mutica (Boissier). Було створено інтрогресивні лінії, що походять від схрещування Авротіка х Аврора та наступного самозапилення. Під час створення інтрогресивних ліній, перевіряли кількість хромосом в первинних корінцях паростків (аналіз метафазних пластинок) для поколінь F3, F4 та F5, та добирали рослини з такою кількістю хромосом, від яких потім можна було отримати 42-хромосомні інтрогресивні лінії. Наявність генетичного матеріалу Т геному Aegilops mutica в геномах інтрогресивних ліній було підтверджено методом дот-блот гібридизації з використанням геномної ДНК Ae. mutica як зонда; для більшості ліній було отримано позитивний сигнал. Оцінка рослин інтрогресивних ліній за деякими ознаками морфології колоса (остистість, форма та щільність колоса, колір зрілого колоса, опушення колосової луски, форма луски тощо) та вегетативної частини рослини (опушення зеленої рослини, воскова осуга), а також за ознакою стійкості до борошнистої роси також вказує на наявність чужинного генетичного матеріалу в їхніх геномах – більшість ліній відрізняються від сорту Аврора за декількома ознаками морфології та мають стійкість до борошнистої роси, яка, за нашими припущеннями, пов’язана з генами стійкості з Т геному. Для встановлення наявності інтрогресій у складі хромосом 5 гомеологічної групи, де за даними літератури локалізовані основні гени, що відповідають за морозостійкість пшениці, було використано мікросателітний аналіз за тими SSR локусами, які вважаються специфічними до хромосом цієї групи. Спочатку було встановлено, праймери до яких мікросателітних локусів утворюють поліморфні продукти для Аврори та Авротіки, і далі за цими SSR локусами було проаналізовано рослини поколінь F4 та F5 (з використанням більшої кількості мікросателітних локусів). Продукти ампліфікації розділяли у поліакриламідному гелі за денатуруючих умов. З ДНК деяких ліній утворювався продукт ампліфікації, що не відрізнявся за електрофоретичною рухливістю від такого, що утворювався з ДНК Аврори. З ДНК інших ліній утворювався продукт ампліфікації, що не відрізнявся від продукту Авротіки, а з ДНК третьої групи ліній утворювався продукт, що був відмінним від продуктів обох батьківських форм (як Аврори, так і Авротіки). Утворення таких продуктів ампліфікації, не властивих жодному з генотипів ініціального схрещування Авротіка х Аврора, може пояснюватися утворенням нових алелів через підвищений рівень мутацій в ділянках SSR локусів. За наявністю алелів мікросателітних локусів, характерних для Авротіки, можна було припустити заміщення цілих хромосом 5-ої групи Аврори на хромосому 5Т Авротіки, або плечей цих хромосом, або формування "мозаїчних" хромосом, в яких чергуються ділянки хроматину Аврори та Авротіки. Утворення таких хромосом можливе через часткову рекомбінацію хромосом Т і D геномів. Для порівняння зимостійкості Аврори та Авротіки спочатку використовували непрямі методи: визначення вмісту вільного проліна, визначення електричної провідності (витікання електролітів), проте, за нашими результатами, характеристики Аврори за цими методами були кращими, ніж Авротіки – Аврора накопичувала більшу кількість вільного проліна від час періоду холодового загартовування, ніж Авротіка, а також Аврора мала менші показники електричної провідності, ніж Авротіка (витікала менша кількість електролітів після заморожування, що може вказувати на менший ступінь пошкоджень мембрани). Було зроблено висновок, що в основі кращої зимостійкості Авротіки, порівняно з Авророю, лежать інші механізми, відмінні від накопичення вільного проліна та меншого витікання електролітів. Під час підготовки паростків Аврори та Авротіки до експерименту з лабораторного заморожування (в спеціальному рідинному термостаті з поступовим зниженням температури) було помічено, що при вирощуванні за низьких позитивних температур (4°С), Авротіка формує міцнішу, краще розвинену кореневу систему у порівнянні з такою Аврори. Це спостереження доло змогу припустити, що особливості кореневої системи Авротіки можуть мати зв’язок з її кращою зимостійкістю, і це було перевірено на наступному етапі дослідження. Щодо експерименту з лабораторного заморожування, то за його результатами Авротіка показала краще відростання, ніж Аврора. Для вивчення розвитку кореневої системи були обрані інтрогресивні лінії, вивчені за структурою геному щодо хромосом 5-ої гомеологічної групи, оскільки показано участь хромосом цієї гомеологічної групи у формуванні ознаки морозостійкість. Розвиток кореневої системи вивчали на рослинах, вирощених у пакетах з ґрунтовою сумішшю, та рослинах, вирощених у польових умовах. Вимірювали такі характеристики кореневої системи: кількість коренів, максимальна довжина кореня, об’єм кореневої системи (визначали за об’ємом рідини, яку витісняє коренева система при зануренні у посудину з рідиною). При порівнянні характеристик кореневої системи Аврори та Авротіки не було виявлено різниці за ознаками довжина найдовшого кореня та кількість коренів, але спостерігалася різниця за ознакою об'єм витісненої рідини. Було припущено, що Авротіка утворює більшу кількість бічних розгалужень коренів, або корені мають більшу товщину. За отриманими результатами, формування більш розвиненої кореневої системи, що оцінювалося за обсягом витісненої рідини, статистично значуще пов’язано з наявністю маркерів (алелів SSR-локусів) хромосоми 5Т замість маркерів хромосоми 5А. Це може вказувати на можливий зв’язок з хромосомою 5А пшениці генів, які беруть участь у формуванні кореневої системи пшениці. Рослини, що вирощували в полі, оцінювали також за кущистістю (кількість продуктивних стебел) та успішністю зимування (кількість рослин, які після зими перейшли до стадії колосіння). Було показано, що Аврора відрізняється від Авротіки за співвідношенням об’єм коренів (за витісненою рідиною)/кущистість у менший бік удвічі. Лінії, які характеризуються високим відношенням об'єм коренів/кущистість, всі, крім однієї, показали більш високий відсоток рослин, що вижили, порівняно з показником Аврори. Отримані результати дали змогу припустити, що стійкість рослин ліній до зимових стресових умов пов’язана з об'ємом кореневої системи відносно продуктивної кущистості та збільшується разом зі зменшенням відношення кількісті продуктивних стебел до об'єму кореневої системи. Для пошуку генів-кандидатів, що можуть впливати на формування кореневої системи, аналізували продукти ампліфікації, що утворюють ДНК Аврори та Авротіки з праймерами до таких генів: AGL21 та AGL14 (гени MADS box транскрипційних факторів, що впливають на накопичення ауксина в корені), BRI – ген рецептора брасиностероїдів (фітогормони, які задіяні у регуляції розвитку коренів). Було перевірено також CBF-A14 – ген транскрипційного фактора родини CBF (C-repeat Binding Factor) – один з основних транскрипційних регуляторів морозостійкості. Між ДНК Аврори та Авротіки не було виявлено поліморфізму за спектрами продуктів ампліфікації з праймерами до генів ТаAGL14, BRI та CBF-A14, тому інтрогресивні лінії не аналізувалися з цими праймерами. AGL21 кодує MADS box транскрипційний фактор, який позитивно регулює накопичення ауксину в примордіях бічних коренів через регуляцію біосинтезу ауксину, який стимулює ініціація і ріст бічних коренів. Показано наявність поліморфізму для продуктів ампліфікації, утворених з праймерами до другої частини гена TaAGL21. Ці праймери були використані для утворення продуктів ампліфікації з ДНК ліній – похідних Авротіки та аналізу продуктів ампліфікації щодо того, чи вони є схожі за масою на продукт Авротіки, чи на продукт Аврори. При порівнянні результатів з оцінкою зимостійкості показано, що лінії з алелем гена ТаAGL21, властивим Авротіці, за успішністю у перенесенні зимових стресів перевищують лінії, яким властивий алель Аврори за цим геном. Рослини для вимірювання характеристик кореневої системи вирощували в поліетиленових пакетах з ґрунтовою сумішшю в 2015 році за умов природного загартовування (поступове зниження температури восени), та в 2016 році в кімнаті контрольованого клімату за оптимальної температури (20°С) без холодового загартовування щоб встановити чи залежить розвиток кореневої системи від наявності/відсутності загартовування рослин і чи пов’язаний цей процес з алелем гена TaAGL21, властивим лініям. За отриманими результатами можна припустити, що природне загартовування сприяє формуванню більш розвиненої кореневої системи через збільшення довжини коренів за наявністю алеля "2" гена AGL21, в той час як без загартовування краще розвивається коренева система у рослин з алелем "1" гена AGL21. За кількістю коренів рослини, вирощені у 2016 році, не відрізнялись від таких, вирощених у 2015 році, можливо, що вираз цієї ознаки не залежить від загартовування. Для ознаки об’єм кореневої системи (визначений за об’ємом витісненої рідини) варіювання навколо групового середнього значення генотипних середніх в різні роки є однаковим для зразків з алелем "1" гена AGL21 та різним для зразків з алелем "2". В 2015 році (за умов загартовування) більш розвинену коренева система (більший об’єм витісненої рідини) мала Авротіка, а в 2016 році (без загартовування) Аврора утворювала більшу кореневу систему порівняно з Авротікою. Отже, за умов низьких температур, Авротіка формує краще розвинену кореневу систему, що може бути пов’язано з алелем "2" гена ALG1, що, в свою чергу, має позитивний зв’язок із зимостійкістю.