091 Біологія та біохімія
Permanent URI for this collection
Освітньо-професійна програма / Освітньо-наукова програма: Біологія
Browse
Browsing 091 Біологія та біохімія by Author "Ємець, Алла"
Now showing 1 - 1 of 1
Results Per Page
Sort Options
Item Дослідження особливості взаємодії івермектину з тубуліном грибного та рослинного походження : дисертація на здобуття наукового ступеня доктора філософії(2025) Кустовський, Євген; Ємець, АллаДисертація на здобуття ступеня доктора філософії в галузі знань 09 "Біологія" за спеціальністю 091 "Біологія". – Національний університет "Києво-Могилянська академія", Київ, 2025. Івермектин є нематоцидом та інсектицидом, активність якого реалізується через зв’язування з Cys-петльовими рецепторами безхребетних. Окрім Cys-петльових рецепторів, відомо про взаємодії івермектину з іншими молекулярними мішенями: фарнезоїдним Х-рецептором, рецептором епідермального фактору росту, α/β-імпортином, NS3 геліказою тощо. Ідентифікація нових мішеней івермектину є підставою для переосмислення можливостей його застосування. До нещодавно встановлених мішеней івермектину належить β-тубулін – консервативний білок еукаріотичних організмів. Гетеродимери α- та β-тубуліну є структурними компонентами мікротрубочок, які є частиною цитоскелету, необхідного для функціонування еукаріотичних клітин. Мікротрубочки забезпечують транспорт органел, синтез клітинної стінки, клітинний поділ тощо. Все це робить α- та β-тубулін мішенню для багатьох лігандів, які через зв'язування з різними сайтами спричиняють стабілізацію або дестабілізацію мікротрубочок, порушуючи клітинний цикл. Наразі відомо про зв’язування івермектину з β-тубуліном нематоди Haemonchus contortus, що призводить до стабілізації мікротрубочок цієї нематоди. Водночас консервативність амінокислотних послідовностей тубуліну еукаріотичних організмів дозволяє припустити, що івермектин може також зв’язуватися з β-тубуліном рослинного та грибного походження, cтабілізуючи мікротрубочки у клітинах рослин та грибів. Дослідження взаємодії івермектину з рослинним та грибним β-тубуліном дозволить оцінити потенціал івермектину як можливого засобу для захисту рослин від грибних патогенів, а також покращити розуміння загрози від застосування івермектину для нецільових організмів. Враховуючи це, дисертаційне дослідження було присвячене вивченню взаємодії івермектину з β-тубуліном рослин і грибів та її наслідків на клітинному та організмовому рівнях. Для вивчення впливу івермектину на вищі рослин як модельний об’єкт було використано дикий тип Arabidopsis thaliana L. (екотип Col-1). У результаті in vitro експериментів було встановлено спричинені івермектином зміни у морфо-фізіологічних параметрах проростків A. thaliana. Зокрема, при вирощуванні проростків A. thaliana на середовищі, що містило івермектин у концентраціях 250 та 500 мкг/мл, спостерігали зменшення загальної довжини проростків та довжини їхніх коренів на 6-ту та 12-ту добу вирощування. Враховуючи, що найбільших змін зазнали корені проростків, було порівняно морфологічні властивості коренів 12-денних проростків у контролі та при вирощуванні на середовищі з івермектином. У результаті було встановлено, що івермектин спричинив сповільнення росту бічних коренів, вкорочення зони елонгації головного кореня, викривлення головного кореня, а також вкорочення та деформацію кореневих волосків. Для пояснення спричинених івермектином морфо-фізіологічних змін у проростків дикого типу A. thaliana було вивчено вплив івермектину на структурно-просторову організацію мікротрубочок клітин головного кореня за використання трансгенних ліній A. thaliana GFP-MAP4 та GFP-TUA6, що експресують химерні гени MAP4 та TUA6, злиті з репортерним геном GFP. У результаті було встановлено, що івермектин у концентрації 250 мкг/мл спричиняє порушення у організації мікротрубочок після 1 та 2 годин обробки; за концентрацій 50 та 100 мкг/мл не спостерігали змін у організації мікротрубочок. Також клітини різних зон кореня мали різну чутливість до дії івермектину: найчутливішими були клітини зони кореневого апексу, перехідної зони та зони елонгації, а найменш чутливими – клітини зони диференціації та кореневі волоски. У чутливих до івермектину клітин спостерігали фрагментацію та вкорочення мікротрубочок, втрату ними орієнтацій, а також виникнення коротких пучків мікротрубочок. Нами було вивчено чутливість фітопатогенних штамів Fusarium graminearum Schwabe (F-55644, F-55748, F-55756) та F. oxysporum Schltdl. (F-52897, F-54635, F-55547, f. sp. lycopersici) до івермектину. Вибір штамів був пов’язаний з тим, що вони є небезпечними патогенами, які вражають зернові та овочеві культури, знижуючи врожайність, а також якість та безпечність агропродукції. У результаті in vitro експериментів було встановлено, що івермектин є токсичним для колоній наведених штамів за концентрацій 2 та 3 мг/мл. Антигрибна активність івермектину не проявлялася за нижчих концентрацій: 0,25; 0,5; та 1 мг/мл. Серед досліджених штамів найчутливішими до івермектину були штами F. graminearum F-55748 та F. oxysporum f. sp. lycopersici, площа колоній яких на 7-му добу вирощування на середовищі з 3 мг/мл івермектину становила менше 50% від площ колоній у контролі. Найменш чутливими до івермектину були штами F. graminearum F-55644 та F-55756. Водночас у колоній цих штамів внаслідок впливу івермектину відбулися фізіологічні зміни: втрата міцелієм кольору та зменшення площі поверхневого міцелію, що також спостерігали у штамів F. oxysporum F-54635 та f. sp. lycopersici. Перед моделюванням взаємодії івермектину та β1-тубуліну A. thaliana, F. graminearum, F. oxysporum та H. contortus (використаний як контроль) порівняли амінокислотні послідовності та конформаційні властивості β-тубуліну цих організмів. Спочатку було зроблено множинне вирівнювання послідовностей β1-тубуліну A. thaliana, F. graminearum, F. oxysporum та H. contortus та порівняно ідентичність та подібність послідовностей загалом та у ділянках елементів вторинної структури таксанового сайту, з яким зв’язується івермектин. У результаті було встановлено, що послідовності β1-тубуліну F. graminearum та F. oxysporum є повністю ідентичними, а тому для моделювання взаємодії було використано лише модель β1-тубуліну F. graminearum. Також було визначено, що послідовності β1-тубуліну A. thaliana та H. contortus є консервативними на 91%, послідовності β1-тубуліну A. thaliana та F. graminearum/F. oxysporum – на 88%, а послідовності β1-тубуліну H. contortus та F. graminearum/F. oxysporum – на 89%. Серед елементів вторинної структури таксанового сайту найбільшу консервативність мала послідовність H1. Найбільші відмінності у послідовностях спостерігали у невпорядкованих петльових ділянок таксанового сайту, а саме М-петлі та S9-S10. У подальшому було проведено молекулярно-динамічні симуляції вільного β1-тубуліну A. thaliana, F. graminearum/F. oxysporum та H. contortus. Аналіз отриманих траєкторій передбачав встановлення інтервалу траєкторій, у якому знаходяться конформації рівноважного стану β1-тубуліну та відбір конформацій з оптимальним розкриттям сайту зв’язування для проведення молекулярного докінгу івермектину. Досягнення структурами рівноважного стану після 40 нс було визначено на підставі результатів аналізу часових змін середньоквадратичного відхилення важких атомів від початкової структури та кількості водневих зв’язків. У результаті кластерного аналізу конформацій таксанового сайту β-тубуліну було ідентифіковано конформації, які характеризуються найбільшим об’ємом порожнини сайту та оптимальним положенням бічних ланцюгів залишків для моделювання зв’язування івермектину. Ці конформації було використано для проведення молекулярного докінгу івермектину. Модель зв’язування івермектину з таксановим сайтом β-тубуліну була розроблена з урахуванням взаємодій івермектину з його відомими мішенями. Зокрема, нами було проаналізовано комплекси івермектину та α-гомопентамерного глутамат-хлоридного рецептора Caenorhabditis elegans, порівняно фізико-хімічні властивості сайтів зв’язування та встановлено патерни алостеричної взаємодії івермектину. Відповідно до запропонованого положення івермектину у таксановому сайті β-тубуліну бензофуранова група івермектину знаходиться у меншій за об’ємом субпорожнині сайту (утворена такими елементами структури як H1, H7 та S9-S10). Макроциклічне кільце та спірокетальна група розташовані в більшій за об’ємом, переважно гідрофобній, субпорожнині сайту (H6, H6-H7, S7, H7 та M-петлі). Гнучка та полярна дисахаридна група розташована за межами цих двох порожнин та відіграє другорядну роль у взаємодії IVM з β1-тубуліном. Стабільність комплексів івермектину та β1-тубуліну A. thaliana, F. graminearum/F. oxysporum та H. contortus було перевірено за допомогою молекулярно-динамічних симуляцій. У результаті MM/PBSA розрахунків було встановлено, що івермектин мав найбільшу афінність до β1-тубуліну A. thaliana, енергія зв’язування з яким становила -12,26±3,33 ккал/моль; нижчу афінність івермектин мав до β1-тубуліну F. graminearum/F. oxysporum (-11,30±5,20 ккал/моль); найнижчу афінність івермектин мав до β1-тубуліну H. contortus (-9,05±5,32 ккал/моль). Для визначення залишків, що мають найбільший внесок у афінність комплексів, було виконано енергетичну декомпозицію загальної енергії зв’язування та проведено аналіз стійкості водневих зв’язків між івермектином та β1-тубуліном. Було встановлено, що взаємодії з залишками у положеннях 27 у H1, 225(224), 228(227) у H7, 277(276) у M-петлі, 319(318) у S8, 360(359) та 362(361) у S9-S10 є найважливішими для підтримання стабільності комплексів. Також здійснили порівняльний аналіз конформаційних властивостей елементів структури таксанового сайту у вільному та зв’язаному з івермектином стані та встановили, що взаємодія івермeктину з β-тубуліном призводить до стабілізації М-петлі. Оскільки стабілізація мікротрубочок лігандами таксанового сайту опосередкована конформаційними змінами М-петлі, було зроблено висновок про можливість стабілізуючого впливу івермектину на мікротрубочки A. thaliana. Це було підтверджено результатами експериментів з вивчення впливу івермектину на структурно-просторову організацію та орієнтацію мікротрубочок у клітинах кореня A. thaliana GFP-MAP4 та GFP-TUA6. Таким чином, у результаті дисертаційного дослідження було вперше визначено структурно-функціональні особливості взаємодії івермектину з β-тубуліном вищих рослин (A. thaliana) та грибів (F. graminearum/F. oxysporum), виявлено зміни у організації мікротрубочок клітин кореня A. thaliana внаслідок дії івермектину, а також його вплив на розвиток A. thaliana, F. graminearum та F. oxysporum. Верифіковано стабільність комплексів івермектину та β1-тубуліну A. thaliana та F. graminearum/F. oxysporum. Отримані дані можуть бути використані для подальшого вивчення взаємодії івермектину з тубуліном інших еукаріотичних організмів, а також для пошуку нових ефективних біологічно активних сполук з високою афінністю до таксанового сайту β-тубуліну.