Роль жорсткості підложки для підтримки плюрипотентності ембріональних стовбурових клітин у культурі in vitro
Loading...
Date
2021
Authors
Білько, Денис
Чайковський, Юрій
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
Ембріональні стовбурові клітини миші (ЕСКм) в умовах культивування in vitro за наявності LIF
(лейкемієінгібіторний фактор) підтримують плюрипотентність, проте при його вилученні (в разі
заміни живильного середовища) наступає активне диференціювання у різні спеціалізовані соматичні
клітини. Метою нашого дослідження було визначення ролі жорсткості підложки для підтримки
плюрипотентності ЕСКм у культурі in vitro. Для реалізації цієї задачі були використані: метод
культивування in vitro, метод "висячої краплі", визначення модуля Юнга для поліакриламідного
гелю різної жорсткості, імуноцитохімічний лужно-фосфатазний стрептавідин-біотиновий метод
(LSAB-AP), мікроскопія. В результаті культивування ЕСКм на підложках з поліакриламідного
гелю м’якої, середньої і жорсткої щільності (0,8, 4,0, 8,0 кПа) виявилося, що на м’якому гелі,
навіть при відсутності LIF, диференціювання не відбувається, клітини продовжують проявляти
ознаки плюрипотентності, а саме створюють шароподібні колонії з високою активністю лужної
фосфатази і формують ембріоїдні тільця, які виявляються методом "висячої краплі". ЕСК,
культивовані на м’якому субстраті, утворювали ембріоїдні тільця, ефективність яких становила
87,5 ± 3,2 на 100 посаджених клітин і не зменшувалася навіть при вилученні LIF. Проте без LIF
стовбурові клітини, культивовані на жорсткій основі демонстрували низький рівень формування
ембріоїдних тілець (23,5 ± 2,24). Результати спостережень переконливо демонструють той факт,
що процес формування ембріоїдних тілець з ЕСК пов’язаний не тільки з наявністю комплексу
факторів у живильному середовищі, але й із складною взаємодією фізичних сил матриксу і механічних
властивостей 3D-клітинних агрегатів. Модель розглядається як спосіб дослідження ранніх подій
у ембріогенезі на шляху пошуків умов для накопичення клітин-попередників і диференційованих
клітин для трансплантацій.
Известно, что в условиях культивирования in vitro в присутствии LIF (лейкемиеингибирующего фактора) эмбриональные стволовые клетки мыши (ЭСКм) поддерживают плюрипотентность, однако при его изъятии (в случае замены питательной среды) наступает активная дифференциация в различные специализированные типы соматических клеток. Целью нашего исследования было определение роли жесткости подложки для поддержания плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток в культуре in vitro. Для реализации этой цели были использованы метод культивирования in vitro, метод "висящей капли", определение модуля Юнга для полиакриламидного геля разной жесткости, иммуноцитохимический стрептавидинбиотиновый метод (LSAB-AP), микроскопия. В результате культивирования ЕСК на подложках из полиакриламидного геля мягкой, средней и жесткой плотности (0,8 4,0, 8,0 кПа) оказалось, что на мягком геле, даже при отсутствии LIF, дифференциации не происходит, клетки продолжают проявлять признаки плюрипотентности, а именно, создают круглые колонии с высокой активностью щелочной фосфатазы и формируют эмбриоидные тельца (ЭТ), которые определяются методом "висящей капли". Результаты показали, что ЕСК, культивированные на мягком субстрате, образовывали ЭТ, эффективность которых равнялась 87,5 ± 3,2 на 100 посаженых клеток и не уменьшалась даже при изъятии LIF. Хотя при отсутствии LIF стволовые клетки, культивированные на жесткой основе, демонстрировали низкий уровень формирования ЭТ (23,5 ± 2,24). Результаты наблюдений убедительно демонстрируют, что процесс формирования ЭТ связан не только с наличием комплекса факторов в питательной среде, но и со сложными взаимодействиями физических сил матрикса и механических свойств 3D-клеточных агрегатов. Модель рассматривается как способ исследования ранних этапов эмбриогенеза на пути поиска условий для накопления клеток-предшественников и дифференцированных клеток для трансплантаций.
Murine embryonic stem cells (ESCm) cultured in vitro in the presence of LIF (leukemia inhibitory factor) maintain pluripotency. However, when LIF is removed from the media, an active differentiation into various specialized somatic cells is observed. The aim of the study was to determine the role of substrate stiffness in maintaining of pluripotency of embryonic stem cells in vitro culture. To this aim, we used the method of culturing pluripotent stem cells in vitro, the method of "hanging drop", the determination of the Young’s modulus for polyacrylamide gel of different hardness, the immunocytochemical alkaline phosphatase (AP) streptavidin-biotin method, microscopy. By culturing ESCm on a soft, medium and hard density polyacrylamide gel as a substrate (0.8, 4.0, 8.0 кPа), we found that on a soft gel ESCm differentiation does not occur even in the absence of LIF. ESCm cultured on a soft substrate continue to show signs of pluripotency, namely, create round compact colonies with high alkaline phosphatase activity and form embryoid bodies (EB), the efficiency of which (87.5 ± 3.2 per 100 cells seeded) did not decrease even after LIF withdrawal. In the absence of LIF, ESCs cultured on a hard base showed a low level of EB formation (23.5 ± 2.24). The results of our observations demonstrate that the process of EB formation may be influenced not only by a composition of nutrient medium, but also by complex interaction between the physical forces of the matrix and the mechanical properties of 3D cell aggregates. The model is considered as a tool to study early events in embryogenesis in the search of conditions for effective culture of progenitor cells and differentiated cells for transplantation.
Известно, что в условиях культивирования in vitro в присутствии LIF (лейкемиеингибирующего фактора) эмбриональные стволовые клетки мыши (ЭСКм) поддерживают плюрипотентность, однако при его изъятии (в случае замены питательной среды) наступает активная дифференциация в различные специализированные типы соматических клеток. Целью нашего исследования было определение роли жесткости подложки для поддержания плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток в культуре in vitro. Для реализации этой цели были использованы метод культивирования in vitro, метод "висящей капли", определение модуля Юнга для полиакриламидного геля разной жесткости, иммуноцитохимический стрептавидинбиотиновый метод (LSAB-AP), микроскопия. В результате культивирования ЕСК на подложках из полиакриламидного геля мягкой, средней и жесткой плотности (0,8 4,0, 8,0 кПа) оказалось, что на мягком геле, даже при отсутствии LIF, дифференциации не происходит, клетки продолжают проявлять признаки плюрипотентности, а именно, создают круглые колонии с высокой активностью щелочной фосфатазы и формируют эмбриоидные тельца (ЭТ), которые определяются методом "висящей капли". Результаты показали, что ЕСК, культивированные на мягком субстрате, образовывали ЭТ, эффективность которых равнялась 87,5 ± 3,2 на 100 посаженых клеток и не уменьшалась даже при изъятии LIF. Хотя при отсутствии LIF стволовые клетки, культивированные на жесткой основе, демонстрировали низкий уровень формирования ЭТ (23,5 ± 2,24). Результаты наблюдений убедительно демонстрируют, что процесс формирования ЭТ связан не только с наличием комплекса факторов в питательной среде, но и со сложными взаимодействиями физических сил матрикса и механических свойств 3D-клеточных агрегатов. Модель рассматривается как способ исследования ранних этапов эмбриогенеза на пути поиска условий для накопления клеток-предшественников и дифференцированных клеток для трансплантаций.
Murine embryonic stem cells (ESCm) cultured in vitro in the presence of LIF (leukemia inhibitory factor) maintain pluripotency. However, when LIF is removed from the media, an active differentiation into various specialized somatic cells is observed. The aim of the study was to determine the role of substrate stiffness in maintaining of pluripotency of embryonic stem cells in vitro culture. To this aim, we used the method of culturing pluripotent stem cells in vitro, the method of "hanging drop", the determination of the Young’s modulus for polyacrylamide gel of different hardness, the immunocytochemical alkaline phosphatase (AP) streptavidin-biotin method, microscopy. By culturing ESCm on a soft, medium and hard density polyacrylamide gel as a substrate (0.8, 4.0, 8.0 кPа), we found that on a soft gel ESCm differentiation does not occur even in the absence of LIF. ESCm cultured on a soft substrate continue to show signs of pluripotency, namely, create round compact colonies with high alkaline phosphatase activity and form embryoid bodies (EB), the efficiency of which (87.5 ± 3.2 per 100 cells seeded) did not decrease even after LIF withdrawal. In the absence of LIF, ESCs cultured on a hard base showed a low level of EB formation (23.5 ± 2.24). The results of our observations demonstrate that the process of EB formation may be influenced not only by a composition of nutrient medium, but also by complex interaction between the physical forces of the matrix and the mechanical properties of 3D cell aggregates. The model is considered as a tool to study early events in embryogenesis in the search of conditions for effective culture of progenitor cells and differentiated cells for transplantation.
Description
Keywords
плюрипотентність, ембріональні стовбурові клітини, ембріоїдні тільця, проліферація, диференціювання, культура in vitro, стаття, плюрипотентность, эмбриональные стволовые клетки, эмбриоидные тельца, пролиферация, дифференциация, культура in vitro, pluripotency, embryonic stem cells, embryoid body, differentiation, culture in vitro
Citation
Білько Д. І. Роль жорсткості підложки для підтримки плюрипотентності ембріональних стовбурових клітин у культурі in vitro / Д. І. Білько, Ю. Б. Чайковський // Фізіологічний журнал. - 2021. - Т. 67, № 3. - С. 27-34.