Ємець, АллаКустовський, Євген2025-06-022025-06-022025Кустовський Є. О. Дослідження особливості взаємодії івермектину з тубуліном грибного та рослинного походження : дисертація на здобуття наукового ступеня доктора філософії / Кустовський Євген Олексійович ; наук. кер. Ємець Алла Іванівна ; Міністерство освіти і науки України, Національний університет "Києво-Могилянська академія". - Київ : [НаУКМА], 2025. - 157 c.https://ekmair.ukma.edu.ua/handle/123456789/34863Dissertation to obtain the scientific degree of Doctor of Philosophy in the field of 09 "Biology" in specialty 091 "Biology". – National University "Kyiv-Mohyla Academy", Kyiv, 2025. The ivermectin is nematocide and insecticide, which activity is based on its binding to Cys-loop receptors of invertebrates (i.e., glutamate receptors, γ-aminobutyric acid receptors). In addition to these traditional targets, ivermectin interacts with other macromolecules (e.g., farnesoid X receptor, epidermal growth factor receptor, α/β-importin, NS3 helicase). Identification of ivermectin’s new molecular targets leads to the necessity to reconsider possible directions of ivermectin’s application. One of the recently identified targets of ivermectin is tubulin – conserved protein of eukaryotic organisms. Heterodimers of α- and β-tubulin are structural components of microtubules, which are the part of cytoskeleton required for functioning of eukaryotic cells. Microtubules are involved in transport of organels, cell wall’s synthesis, signal cascades, cell division, etc. These makes α- and β-tubulin target for many ligands, which via binding to different sites cause stabilization or destabilization of microtrubules thus disrupting the cell cycle. It is known that ivermectin binds to β-tubulin of Haemonchus contortus, which leads to the stabilization of microtubules. The conservation of aminoacid sequences of eukaryotic tubulin allows us to hypothesize that ivermectin may also bind to β-tubulin of plant and fungal origin stabilizing microtubules in cells of plants and fungies. The research of ivermectin’s interaction with tubulin of plant and fungal origin is nesessary to evaluate ivermectin’s potential as a possible agent for plant protection from phytophatogenic fungies and to improve the understanding of ivermectin’s threat for non-target organisms. Considering the above, this research aimed to study ivermectin’s interaction with tubulin of plants and fungies and its consequences on cellular and organismal levels. To study ivermectin influence on higher plants the wild type of Arabidopsis thaliana L. (ecotype Col-1) was selected as model object. As the result of in vitro experiments, ivermectin-induced changes in morpho-physiological properties of A. thaliana seedlings were determined. Particularly, while cultivating A. thaliana seedlings on medium, which contained ivermectin in concentrations of 250 and 500 μg/ml, the reduction of seedlings length was observed on 6 and 12 day of growth. Considering that the most significant morphological alterations were observed for roots of seedlings, morphological properties of 12-day seedlings grown on normal and ivermectin-supplemented medium were compared. Consequently, it was determined that ivermectin caused the delay in growth of lateral roots, the reduction of elongation zone of primary root, the curvature of primary root, and the shortening and deformation of root hair. To explain morpho-physiological alterations of A. thaliana wild type seedlings for the first time ivermectin influence on the organization of microtubules in primary root cells of A. thaliana transgenic lines GFP-MAP4 and GFP-TUA6, which express MAP4 and TUA6 genes fused with the reporter GFP gene. As the result, it was determined that ivermectin in concentration of 250 μg/ml disrupts microtubules’ organization after 1 and 2 hours of exposure; at concentrations of 50 and 100 μg/ml no changes in microtubules’ organization were observed. Also, cells of different root zones had different susceptibility to ivermectin’s action: particularly, the cells of root apex, transition zone, and elongation zone were the most susceptible to ivermectin; the least susceptible were cells of differentiation zone and root hair. In susceptible to ivermectin cells were observed fragmentation and shortening of microtubules, loss of their orientations, and the formation of short bundles of microtubules. The susceptibility of phytopathogenic strains of Fusarium graminearum Schwabe (F-55644, F-55748, F-55756) and F. oxysporum Schltdl. (F-52897, F-54635, F-55547, f. sp. lycopersici) to ivermectin was studied. These strains were selected as dangerous pathogens of cereal and vegetable crops, which cause yield losses and the decrease of quality and safety of agricultural products. As the result of in vitro experiments, it was found that ivermectin causes delays of growth of the strains’ colonies at concentrations of 2 and 3 mg/ml. The antifungal activity of ivermectin was not observed at concentrations of 0.25, 0.5, and 1 mg/ml. Among the studied strains, F. graminearum F-55748 and F. oxysporum f. sp. lycropersici were the most susceptible to ivermectin as the mean area of their colonies on the 7th day of growth on medium supplemented with 3 mg/ml of ivermectin was less than 50% as compared to the area in control. The least susceptible to ivermectin were strains F. graminearum F-55644 and F-55756. In the meantime, under the influence of ivermectin, the loss of color and the decrease in area of surface mycelium was observed for these strains, which was also observed for F. oxysporum’s strains F-54635 and f. sp. lycopersici. Prior to modelling of ivermectin interactions with β1-tubulin of A. thaliana, F. graminearum, F. oxysporum, and H. contortus (used as control), the comparison of aminoacid sequences and conformational properties of β-tubulin of these organisms was performed. Inititally, the multiple sequence alignment of the sequences of β1-tubulin of A. thaliana, F. graminearum, F. oxysporum, and H. contortus was done and the identity and similarity of sequences in general and in regions of secondary structure elements of taxane site, to which ivermectin binds, was compared. As the result, it was determined that the sequences of β1-tubulin of F. graminearum and F. oxysporum are totally identical; thus, only the model of β1-tubulin of F. graminearum was used in the study of ivermectin-tubulin interactions. Also, it was determined that sequences of β1-tubulin of A. thaliana and H. contortus exhibit 91% conservation, sequences of β1-tubulin of A. thaliana and Fusarium – 88%, and sequences of β1-tubulin H. contortus and F. graminearum/F.oxysporum – 89%. Among the elements of secondary structure of taxane site H1 had the most conserved sequence; it was found that the most diverged sequences had unstable loop segments, i.e, M-loop and S9-S10. Further, the molecular dynamics simulations of the unbound β1-tubulin of A. thaliana, F. graminearum, and H. contortus were performed and the resulting trajectories were analyzed. The analysis of trajectories included determination of time interval, which contains conformations of β1-tubulin equilibrium state and selection of conformations with optimal opening of taxane site to perform the molecular docking of ivermectin. Based on the time-dependent changes in root mean squared deviation of heavy atoms on each frame from the original structures and number of hydrogen bonds, it was determined that the structures reached equilibrium state after 40 ns. As the result of cluster analysis, conformations characterized by the largest volume of site cavity and the optimal position of side chains for modelling of ivermectin binding were identified. These conformations were used for the molecular docking of ivermectin. The model of ivermectin binding to β-tubulin was developed in consideration with ivermectin’s interactions with its known targets. Particularly, the ivermectin complexes with α-homopentameric glutamate receptor of Caenorhabditis elegans from RCSB PDB (identificators 3RHW and 3RIF) were analyzed, physico-chemical properties of binding sites were compared, and patterns of ivermectin’s allosteric interaction with these targets were determined. According to the proposed position of ivermectin in binding site, the benzofuran group of ivermectin is located in the smaller subcavity of taxane site surrounded by polar and charged residues of H1, H7, and S9-S10. The macrocyclic ring and the spiroketal group are located in the larger primarily hydrophobic cavity formed by residues of H6, H6-H7, S7, H7, and M-loop. The flexible and polar disaccharide group of ivermectin is located outside these two cavities and has secondary role in interactions. The stability of ivermectin’s complexes with β1-tubulin of A. thaliana, F. graminearum/F.oxysporum, and H. contortus was verified using molecular dynamics simulations. As the result of MM/PBSA calculations, it was determined that ivermectin had the highest affinity for β1-tubulin of A. thaliana with the binding energy of -12.26±3.33 kcal/mol. The complex of ivermectin and β1-tubulin of F. graminearum/F.oxysporum had lower affinity (-11.30±5.20 kcal/mol). The lowest affinity was observed in the complex of ivermectin and β1-tubulin of H. contortus (-9.05±5.32 kcal/mol). To determine residues which had the highest contribution to comlpexes’ affinities the energy decomposition was performed and the persistence of hydrogen bonds between ivermectin and β1-tubulin was analyzed. It was determined that interactions with residues in positions 27 of H1, 225(224), 228(227) of H7, 277(276) of M-loop, 319(318) of S8, 360(359) and 362(361) of S9-S10 are the most crucial for the maintenance of complexes’ stability. Also, with the comparative analysis of taxane site’s conformational properties in unbound and ivermectin-bound states it was found that ivermectin’s binding to the studied β1-tubulin structures causes spiralization and stabilization of M-loop. Considering that stabilization of microtubules by ligands of taxane site is mediated by conformational changes of M-loop, it was concluded that ivermectin can have stabilizing effect on microtubules A. thaliana. This conclusion is also supported with the results of experimental studies of ivermectin influence on the organization and orientation of microtubules in cells of A. thaliana GFP-MAP4 and GFP-TUA6 roots. Consequently, for the first time were determined structural and functional specifics of the ivermectin’s interaction with β-tubulin of higher plants (A. thaliana) and filamentous fungies (F. graminearum/F. oxysporum), ivermectin-induced changes in the organization of plant microtubules, and also ivermectin’s influence on the development of A. thaliana, F. graminearum, F. oxysporum. The stability of ivermectin complexes with β1-tubulin of A. thaliana, H. contortus, and F. graminearum/F. oxysporum was verified. The results of research provide foundations for future studies of ivermectin interactions with tubulin of other eukaryotic organisms and for the search of new effective biologically active substances with high affinity for the taxane site of β-tubulin on the basis of ivermectin structure.Дисертація на здобуття ступеня доктора філософії в галузі знань 09 "Біологія" за спеціальністю 091 "Біологія". – Національний університет "Києво-Могилянська академія", Київ, 2025. Івермектин є нематоцидом та інсектицидом, активність якого реалізується через зв’язування з Cys-петльовими рецепторами безхребетних. Окрім Cys-петльових рецепторів, відомо про взаємодії івермектину з іншими молекулярними мішенями: фарнезоїдним Х-рецептором, рецептором епідермального фактору росту, α/β-імпортином, NS3 геліказою тощо. Ідентифікація нових мішеней івермектину є підставою для переосмислення можливостей його застосування. До нещодавно встановлених мішеней івермектину належить β-тубулін – консервативний білок еукаріотичних організмів. Гетеродимери α- та β-тубуліну є структурними компонентами мікротрубочок, які є частиною цитоскелету, необхідного для функціонування еукаріотичних клітин. Мікротрубочки забезпечують транспорт органел, синтез клітинної стінки, клітинний поділ тощо. Все це робить α- та β-тубулін мішенню для багатьох лігандів, які через зв'язування з різними сайтами спричиняють стабілізацію або дестабілізацію мікротрубочок, порушуючи клітинний цикл. Наразі відомо про зв’язування івермектину з β-тубуліном нематоди Haemonchus contortus, що призводить до стабілізації мікротрубочок цієї нематоди. Водночас консервативність амінокислотних послідовностей тубуліну еукаріотичних організмів дозволяє припустити, що івермектин може також зв’язуватися з β-тубуліном рослинного та грибного походження, cтабілізуючи мікротрубочки у клітинах рослин та грибів. Дослідження взаємодії івермектину з рослинним та грибним β-тубуліном дозволить оцінити потенціал івермектину як можливого засобу для захисту рослин від грибних патогенів, а також покращити розуміння загрози від застосування івермектину для нецільових організмів. Враховуючи це, дисертаційне дослідження було присвячене вивченню взаємодії івермектину з β-тубуліном рослин і грибів та її наслідків на клітинному та організмовому рівнях. Для вивчення впливу івермектину на вищі рослин як модельний об’єкт було використано дикий тип Arabidopsis thaliana L. (екотип Col-1). У результаті in vitro експериментів було встановлено спричинені івермектином зміни у морфо-фізіологічних параметрах проростків A. thaliana. Зокрема, при вирощуванні проростків A. thaliana на середовищі, що містило івермектин у концентраціях 250 та 500 мкг/мл, спостерігали зменшення загальної довжини проростків та довжини їхніх коренів на 6-ту та 12-ту добу вирощування. Враховуючи, що найбільших змін зазнали корені проростків, було порівняно морфологічні властивості коренів 12-денних проростків у контролі та при вирощуванні на середовищі з івермектином. У результаті було встановлено, що івермектин спричинив сповільнення росту бічних коренів, вкорочення зони елонгації головного кореня, викривлення головного кореня, а також вкорочення та деформацію кореневих волосків. Для пояснення спричинених івермектином морфо-фізіологічних змін у проростків дикого типу A. thaliana було вивчено вплив івермектину на структурно-просторову організацію мікротрубочок клітин головного кореня за використання трансгенних ліній A. thaliana GFP-MAP4 та GFP-TUA6, що експресують химерні гени MAP4 та TUA6, злиті з репортерним геном GFP. У результаті було встановлено, що івермектин у концентрації 250 мкг/мл спричиняє порушення у організації мікротрубочок після 1 та 2 годин обробки; за концентрацій 50 та 100 мкг/мл не спостерігали змін у організації мікротрубочок. Також клітини різних зон кореня мали різну чутливість до дії івермектину: найчутливішими були клітини зони кореневого апексу, перехідної зони та зони елонгації, а найменш чутливими – клітини зони диференціації та кореневі волоски. У чутливих до івермектину клітин спостерігали фрагментацію та вкорочення мікротрубочок, втрату ними орієнтацій, а також виникнення коротких пучків мікротрубочок. Нами було вивчено чутливість фітопатогенних штамів Fusarium graminearum Schwabe (F-55644, F-55748, F-55756) та F. oxysporum Schltdl. (F-52897, F-54635, F-55547, f. sp. lycopersici) до івермектину. Вибір штамів був пов’язаний з тим, що вони є небезпечними патогенами, які вражають зернові та овочеві культури, знижуючи врожайність, а також якість та безпечність агропродукції. У результаті in vitro експериментів було встановлено, що івермектин є токсичним для колоній наведених штамів за концентрацій 2 та 3 мг/мл. Антигрибна активність івермектину не проявлялася за нижчих концентрацій: 0,25; 0,5; та 1 мг/мл. Серед досліджених штамів найчутливішими до івермектину були штами F. graminearum F-55748 та F. oxysporum f. sp. lycopersici, площа колоній яких на 7-му добу вирощування на середовищі з 3 мг/мл івермектину становила менше 50% від площ колоній у контролі. Найменш чутливими до івермектину були штами F. graminearum F-55644 та F-55756. Водночас у колоній цих штамів внаслідок впливу івермектину відбулися фізіологічні зміни: втрата міцелієм кольору та зменшення площі поверхневого міцелію, що також спостерігали у штамів F. oxysporum F-54635 та f. sp. lycopersici. Перед моделюванням взаємодії івермектину та β1-тубуліну A. thaliana, F. graminearum, F. oxysporum та H. contortus (використаний як контроль) порівняли амінокислотні послідовності та конформаційні властивості β-тубуліну цих організмів. Спочатку було зроблено множинне вирівнювання послідовностей β1-тубуліну A. thaliana, F. graminearum, F. oxysporum та H. contortus та порівняно ідентичність та подібність послідовностей загалом та у ділянках елементів вторинної структури таксанового сайту, з яким зв’язується івермектин. У результаті було встановлено, що послідовності β1-тубуліну F. graminearum та F. oxysporum є повністю ідентичними, а тому для моделювання взаємодії було використано лише модель β1-тубуліну F. graminearum. Також було визначено, що послідовності β1-тубуліну A. thaliana та H. contortus є консервативними на 91%, послідовності β1-тубуліну A. thaliana та F. graminearum/F. oxysporum – на 88%, а послідовності β1-тубуліну H. contortus та F. graminearum/F. oxysporum – на 89%. Серед елементів вторинної структури таксанового сайту найбільшу консервативність мала послідовність H1. Найбільші відмінності у послідовностях спостерігали у невпорядкованих петльових ділянок таксанового сайту, а саме М-петлі та S9-S10. У подальшому було проведено молекулярно-динамічні симуляції вільного β1-тубуліну A. thaliana, F. graminearum/F. oxysporum та H. contortus. Аналіз отриманих траєкторій передбачав встановлення інтервалу траєкторій, у якому знаходяться конформації рівноважного стану β1-тубуліну та відбір конформацій з оптимальним розкриттям сайту зв’язування для проведення молекулярного докінгу івермектину. Досягнення структурами рівноважного стану після 40 нс було визначено на підставі результатів аналізу часових змін середньоквадратичного відхилення важких атомів від початкової структури та кількості водневих зв’язків. У результаті кластерного аналізу конформацій таксанового сайту β-тубуліну було ідентифіковано конформації, які характеризуються найбільшим об’ємом порожнини сайту та оптимальним положенням бічних ланцюгів залишків для моделювання зв’язування івермектину. Ці конформації було використано для проведення молекулярного докінгу івермектину. Модель зв’язування івермектину з таксановим сайтом β-тубуліну була розроблена з урахуванням взаємодій івермектину з його відомими мішенями. Зокрема, нами було проаналізовано комплекси івермектину та α-гомопентамерного глутамат-хлоридного рецептора Caenorhabditis elegans, порівняно фізико-хімічні властивості сайтів зв’язування та встановлено патерни алостеричної взаємодії івермектину. Відповідно до запропонованого положення івермектину у таксановому сайті β-тубуліну бензофуранова група івермектину знаходиться у меншій за об’ємом субпорожнині сайту (утворена такими елементами структури як H1, H7 та S9-S10). Макроциклічне кільце та спірокетальна група розташовані в більшій за об’ємом, переважно гідрофобній, субпорожнині сайту (H6, H6-H7, S7, H7 та M-петлі). Гнучка та полярна дисахаридна група розташована за межами цих двох порожнин та відіграє другорядну роль у взаємодії IVM з β1-тубуліном. Стабільність комплексів івермектину та β1-тубуліну A. thaliana, F. graminearum/F. oxysporum та H. contortus було перевірено за допомогою молекулярно-динамічних симуляцій. У результаті MM/PBSA розрахунків було встановлено, що івермектин мав найбільшу афінність до β1-тубуліну A. thaliana, енергія зв’язування з яким становила -12,26±3,33 ккал/моль; нижчу афінність івермектин мав до β1-тубуліну F. graminearum/F. oxysporum (-11,30±5,20 ккал/моль); найнижчу афінність івермектин мав до β1-тубуліну H. contortus (-9,05±5,32 ккал/моль). Для визначення залишків, що мають найбільший внесок у афінність комплексів, було виконано енергетичну декомпозицію загальної енергії зв’язування та проведено аналіз стійкості водневих зв’язків між івермектином та β1-тубуліном. Було встановлено, що взаємодії з залишками у положеннях 27 у H1, 225(224), 228(227) у H7, 277(276) у M-петлі, 319(318) у S8, 360(359) та 362(361) у S9-S10 є найважливішими для підтримання стабільності комплексів. Також здійснили порівняльний аналіз конформаційних властивостей елементів структури таксанового сайту у вільному та зв’язаному з івермектином стані та встановили, що взаємодія івермeктину з β-тубуліном призводить до стабілізації М-петлі. Оскільки стабілізація мікротрубочок лігандами таксанового сайту опосередкована конформаційними змінами М-петлі, було зроблено висновок про можливість стабілізуючого впливу івермектину на мікротрубочки A. thaliana. Це було підтверджено результатами експериментів з вивчення впливу івермектину на структурно-просторову організацію та орієнтацію мікротрубочок у клітинах кореня A. thaliana GFP-MAP4 та GFP-TUA6. Таким чином, у результаті дисертаційного дослідження було вперше визначено структурно-функціональні особливості взаємодії івермектину з β-тубуліном вищих рослин (A. thaliana) та грибів (F. graminearum/F. oxysporum), виявлено зміни у організації мікротрубочок клітин кореня A. thaliana внаслідок дії івермектину, а також його вплив на розвиток A. thaliana, F. graminearum та F. oxysporum. Верифіковано стабільність комплексів івермектину та β1-тубуліну A. thaliana та F. graminearum/F. oxysporum. Отримані дані можуть бути використані для подальшого вивчення взаємодії івермектину з тубуліном інших еукаріотичних організмів, а також для пошуку нових ефективних біологічно активних сполук з високою афінністю до таксанового сайту β-тубуліну.ukівермектинтубулінцитоскелетмікротрубочкимолекулярно-клітинні механізмиріст клітинArabidopsisкоріньстійкість рослинпатогениFusariumантигрибна активністьin silicoмолекулярний докінгмолекулярна динамікадисертаціяIvermectintubulincytoskeletonmicrotubulesmolecular and cellular mechanismscell growthArabidopsisplant rootplant resistancepathogensFusariumantifungal activityin silicomolecular dockingmolecular dynamicsThesis